Vse biokemične reakcije, ki se pojavljajo v telesu, so predmet posebnega nadzora, ki se izvaja z aktivacijskim ali zaviralnim učinkom na regulatorne encime. Slednji se običajno nahajajo na začetku verig presnovnih transformacij in bodisi začnejo večstopenjski proces ali ga upočasnijo. Nekatere posamezne reakcije so prav tako predmet regulacije. Konkurenčna inhibicija je eden od glavnih mehanizmov za nadzor katalitične aktivnosti encimov.
Kaj je inhibicija?
Mehanizem encimske katalize temelji na vezavi aktivnega mesta encima na molekulo substrata (ES kompleks), kar povzroči kemično reakcijo s tvorbo in sproščanjem produkta (E+S=ES=EP=E+P).
Inhibicija encima je zmanjšanje hitrosti ali popolna zaustavitev procesa katalize. V ožjemTa izraz pomeni zmanjšanje afinitete aktivnega središča za substrat, ki ga dosežemo z vezavo encimskih molekul na inhibitorne snovi. Slednji lahko delujejo na različne načine, na podlagi katerih jih delimo na več tipov, ki ustrezajo istoimenskim inhibicijskim mehanizmom.
Glavne vrste zaviranja
Po naravi procesa je lahko zaviranje dveh vrst:
- Nepovratno - povzroči trajne spremembe v molekuli encima, ki ji odvzame funkcionalno aktivnost (slednje ni mogoče obnoviti). Lahko je specifična ali nespecifična. Zaviralec se močno veže na encim s kovalentno interakcijo.
- Reverzibilno - glavna vrsta negativne regulacije encimov. Izvaja se zaradi reverzibilne specifične vezave inhibitorja na encimski protein s šibkimi nekovalentnimi vezmi, ki jih je mogoče opisati po Michaelis-Mentenovi enačbi (z izjemo alosterične regulacije).
Obstajata dve glavni vrsti reverzibilne inhibicije encimov: konkurenčna (lahko se oslabi s povečanjem koncentracije substrata) in nekonkurenčna. V slednjem primeru se največja možna hitrost katalize zmanjša.
Glavna razlika med konkurenčno in nekonkurenčno inhibicijo je v mestu pritrditve regulatorne snovi na encim. V prvem primeru se inhibitor veže neposredno na aktivno mesto, v drugem primeru pa na drugo mesto encima ali na kompleks encim-substrat.
Obstaja tudi mešana vrsta inhibicije, pri kateri vezava na inhibitor ne prepreči nastanka ES, ampak upočasni katalizo. V tem primeru je regulatorna snov v sestavi dvojnih ali trojnih kompleksov (EI in EIS). Pri nekonkurenčnem tipu se encim veže samo na ES.
Lastnosti reverzibilne konkurenčne inhibicije encimov
Konkurenčni mehanizem inhibicije temelji na strukturni podobnosti regulacijske snovi s substratom. Posledično nastane kompleks aktivnega centra z zaviralcem, ki ga običajno označujemo kot EI.
Reverzibilna konkurenčna inhibicija ima naslednje značilnosti:
- veza na inhibitor se pojavi na aktivnem mestu;
- inaktivacija molekule encima je reverzibilna;
- zaviralni učinek je mogoče zmanjšati s povečanjem koncentracije substrata;
- inhibitor ne vpliva na največjo hitrost encimske katalize;
- kompleks EI se lahko razgradi, za kar je značilna ustrezna disociacijska konstanta.
Pri tej vrsti regulacije se zdi, da inhibitor in substrat tekmujeta (tekmujeta) drug z drugim za mesto v aktivnem središču, od tod tudi ime procesa.
Zaradi tega lahko konkurenčno inhibicijo opredelimo kot reverzibilen proces inhibicije encimske katalize, ki temelji na specifični afiniteti aktivnega mesta za zaviralno snov.
Mehanizem delovanja
Privezovanjeinhibitor z aktivnim mestom preprečuje nastanek kompleksa encim-substrat, ki je potreben za katalizo. Posledično molekula encima postane neaktivna. Kljub temu se lahko katalitični center veže ne samo na inhibitor, ampak tudi na substrat. Verjetnost nastanka enega ali drugega kompleksa je odvisna od razmerja koncentracij. Če je substratnih molekul bistveno več, bo encim z njimi reagiral pogosteje kot z inhibitorjem.
Vpliv na hitrost kemične reakcije
Stopnja inhibicije katalize med tekmovalno inhibicijo je določena s tem, kolikšen del encima bo tvoril EI-komplekse. V tem primeru je mogoče povečati koncentracijo substrata do te mere, da se bo nadomestila vloga inhibitorja, hitrost katalize pa bo dosegla največjo možno vrednost, ki ustreza vrednosti Vmaxv skladu z enačbo Michaelis-Menten.
Ta pojav je posledica močne razredčenosti inhibitorja. Posledično se verjetnost, da se nanj vežejo encimske molekule, zmanjša na nič, aktivni centri pa reagirajo samo s substratom.
Kinetične odvisnosti encimske reakcije, ki vključuje kompetitivni zaviralec
Konkurentna inhibicija poveča Michaelisovo konstanto (Km), ki je enaka koncentraciji substrata, ki je potrebna za doseganje ½ največje hitrosti katalize na začetku reakcije. Količina encima, ki se hipotetično lahko veže na substrat, ostane konstantna, medtem ko število ES-kompleksi so odvisni le od koncentracije slednjega (kompleksi EI niso konstantni in jih substrat lahko izpodriva).
Konkurenčno inhibicijo encimov je enostavno določiti iz grafov kinetične odvisnosti, zgrajenih za različne koncentracije substrata. V tem primeru se bo vrednost Km spremenila, medtem ko bo Vmax ostala konstantna.
Pri nekonkurenčni inhibiciji je ravno obratno: inhibitor se veže zunaj aktivnega centra in prisotnost substrata na to nikakor ne more vplivati. Posledično se nekatere molekule encimov "izklopijo" iz katalize in največja možna hitrost se zmanjša. Kljub temu se aktivne encimske molekule zlahka vežejo na substrat tako pri nizkih kot pri visokih koncentracijah slednjega. Zato Michaelisova konstanta ostane konstantna.
Grafi tekmovalne inhibicije v sistemu dvojnih inverznih koordinat so več ravnih črt, ki sekajo os y v točki 1/Vmax. Vsaka ravna črta ustreza določeni koncentraciji substrata. Različne točke presečišča z osjo abscise (1/[S]) kažejo na spremembo Michaelisove konstante.
Delovanje konkurenčnega inhibitorja na primeru malonata
Tipičen primer kompetitivne inhibicije je proces zmanjšanja aktivnosti sukcinat dehidrogenaze, encima, ki katalizira oksidacijo jantarne kisline (sukcinata) v fumarno kislino. Tukaj kot zaviralecmalonat deluje in ima strukturno podobnost s sukcinatom.
Dodajanje inhibitorja v medij povzroči nastanek kompleksov malonata s sukcinat dehidrogenazo. Takšna vez ne poškoduje aktivnega mesta, ampak blokira njegovo dostopnost do jantarne kisline. Povečanje koncentracije sukcinata zmanjša zaviralni učinek.
Medicinska uporaba
Delovanje številnih zdravil, ki so strukturni analogi substratov nekaterih presnovnih poti, katerih zaviranje je nujen del zdravljenja bolezni, temelji na mehanizmu kompetitivne inhibicije..
Na primer, za izboljšanje prevodnosti živčnih impulzov pri mišičnih distrofijah je potrebno povečati raven acetilholina. To dosežemo z zaviranjem aktivnosti njegove hidrolizirajoče acetilholinesteraze. Zaviralci so kvartarne amonijeve baze, ki so del zdravil (proresin, endrofonij itd.).
V posebno skupino ločimo antimetabolite, ki poleg zaviralnih učinkov kažejo lastnosti psevdosubstrata. V tem primeru tvorba kompleksa EI vodi v nastanek biološko inertnega anomalnega produkta. Antimetaboliti vključujejo sulfonamide (uporabljajo se pri zdravljenju bakterijskih okužb), nukleotidne analoge (uporabljajo se za zaustavitev rasti celic rakavega tumorja) itd.
