Kaj je osnova hibridizacije DNK? Čeprav je zaporedje dvojne verige DNK na splošno stabilno v fizioloških pogojih, bo sprememba teh pogojev v laboratoriju (običajno z zvišanjem temperature okolja) povzročila, da se molekule ločijo v posamezne verige. Slednji se med seboj dopolnjujejo, lahko pa dopolnjujejo tudi druga zaporedja, ki so prisotna v njihovem okolju. Znižanje temperature okolice omogoča, da se enoverižne molekule med seboj žarijo ali "hibridizirajo". To je metoda hibridizacije DNK.
Koncept z vidika molekularne biologije
Znanstveniki, ki sodelujejo tako pri replikaciji DNK kot pri transkripciji DNK v RNA, se zanašajo na nukleotidne prehode in tehnike molekularne biologije. To vključuje Southern in Northern blots, polimerazno verižno reakcijo (PCR) in večino pristopov hibridizacije in sekvenciranja DNA-RNA.
Prijava
Hibridizacija je glavna lastnost nukleotidazaporedja in se uporablja v številnih metodah molekularne biologije. Celoten genetski odnos dveh vrst je mogoče določiti s hibridizacijo segmentov njune DNK (hibridizacija DNK-DNK). Zaradi podobnosti zaporedja med tesno sorodnimi organizmi je za taljenje takšnih hibridov DNK potrebna višja temperatura v primerjavi z bolj oddaljenimi organizmi. Različne metode uporabljajo hibridizacijo za določitev izvora vzorca DNK, vključno s polimerazno verižno reakcijo (PCR). Pri drugi metodi so kratke sekvence DNK hibridizirane s celično mRNA, da se identificirajo izraženi geni. Farmacevtska podjetja raziskujejo uporabo protismiselne RNA za vezavo na neželeno mRNA, kar preprečuje, da bi ribosom prevedel mRNA v beljakovine.
DNA-DNA hibridizacija se na splošno nanaša na tehniko molekularne biologije, ki meri stopnjo genetske podobnosti med skupinami zaporedij DNK. Običajno se uporablja za določanje genetske razdalje med dvema organizmoma. Široko se uporablja v filogeniji in taksonomiji.
metodologija
DNK iz enega organizma je bila označena, nato pa pomešana z neoznačeno DNK, ki bi jo lahko primerjali z njo. Zmes inkubiramo, da se verige DNK disociirajo in nato ohladijo, da nastane regenerirana hibridna dvoverižna DNK. Hibridizirana zaporedja z visoko stopnjo podobnosti se tesneje vežejo in zahtevajo več energije, da jih ločijo: to pomeni, da se ločijo, ko se segrejejo pri višjitemperaturo kot različne sekvence, proces, znan kot "taljenje DNK".
taljenje DNK
Ko ocenimo profil taljenja hibridizirane DNK, se dvoverižna DNK veže na tako imenovani "stolpec" in nastalo zmes segrejemo. Na vsakem koraku kolono speremo in zaporedja DNK, ki se stopijo, postanejo enoverižna in sperejo kolono. Temperature, pri katerih označena DNK izstopi iz stolpca, odražajo količino podobnosti med zaporedji (in samozložljiv vzorec služi kot kontrola). Ti rezultati so združeni za določitev stopnje genetske podobnosti med organizmi. Po sodobni mikrobiologiji je hibridizacija DNK nemogoča brez razumevanja teh stvari.
Ko se na ta način primerja več vrst ribonukleinske kisline (ali deoksiribonukleinske) kisline, vrednosti podobnosti omogočajo, da se vrsta uvrsti v filogenetsko drevo. Zato je to eden od možnih pristopov za izvajanje molekularne sistematike. Charles Sibley in John Ahlquist, pionirja te tehnike, sta uporabila hibridizacijo DNK in DNK za preučevanje filogenetskih odnosov ptic (taksonomija Sibley-Ahlquist) in primatov.
Pomen za biologijo
DNA-DNA hibridizacija je zlati standard za razlikovanje bakterijskih vrst, z vrednostjo podobnosti več kot 70 %, kar kaže, da primerjani sevi pripadajo različnim vrstam. Leta 2014 je bil za ločevanje bakterijske podvrste predlagan prag 79-odstotne podobnosti.
Kritiki trdijo, da je tehnika netočna za primerjavo tesno sorodnih vrst, saj je vsak poskus merjenja razlik med ortolognimi zaporedji med organizmi preobremenjen s hibridizacijo paralognih dvojnikov v genomu organizma. Zaporedje DNK in primerjave računalniških zaporedij sta trenutno pogosto uporabljena metoda za določanje genetske razdalje, čeprav se ta pristop še vedno uporablja v mikrobiologiji za pomoč pri identifikaciji bakterij.
Trenutni način je izvedba hibridizacije DNK-DNK v silikonu z uporabo popolnoma ali delno sekvenciranih genomov. GGDC, ki ga je razvil DSMZ, je najbolj natančno znano orodje za izračun vrednosti, podobnih DDH. Med drugimi algoritemskimi izboljšavami rešuje problem paralognih zaporedij tako, da jih skrbno filtrira iz ujemanj med dvema zaporedjema genoma.
FISH metoda
Fluorescenčna in situ hibridizacija (FISH) je laboratorijska tehnika, ki se uporablja za odkrivanje in sekvenciranje DNK, pogosto na določenem kromosomu.
Leta 1969 sta Joseph Gall in Mary Lou Pardu objavila članek, ki dokazuje, da je mogoče radioaktivne kopije zaporedja ribosomske DNK uporabiti za odkrivanje komplementarnih sekvenc DNK v jedru žabjega jajčeca. Od teh prvotnih opažanj so številne izboljšave povečale vsestranskost inobčutljivost postopka do te mere, da in situ hibridizacija (»na mestu«, latinsko) zdaj velja za pomembno orodje v citogenetiki. (Izraz in situ se zdaj uporablja tudi za začetno stopnjo rasti karcinoma, ko je v patološki proces vključeno samo epitelijsko tkivo.)
Fluorescentno hibridizacijsko zaporedje
RNA sonde je mogoče oblikovati za kateri koli gen ali katero koli zaporedje znotraj gena za vizualizacijo lncRNA in miRNA mRNA v tkivih in celicah. FISH se uporablja za preučevanje cikla celične reprodukcije, zlasti jedrske interfaze za morebitne kromosomske nepravilnosti. FISH vam omogoča analizo velike serije arhivskih primerov, veliko lažje je identificirati identificiran kromosom z ustvarjanjem sonde z umetno kromosomsko bazo, ki bo pritegnila podobne kromosome.
Hibridizacijski signali za vsako sondo, ko se odkrije jedrska nepravilnost: vsaka sonda za odkrivanje mRNA in lncRNA je sestavljena iz 20 parov oligonukleotidov, vsak par pokriva prostor 40-50 bp. p. Sonde uporabljajo lastno kemijo za odkrivanje mRNA.
Hibridizacija z DNK sondami
Sonde so pogosto narejene iz fragmentov DNK, ki so bili izolirani, prečiščeni in ojačani za uporabo pri oblikovanju človeškega genoma. Velikost človeškega genoma je tako velika v primerjavi z dolžino, ki jo je mogoče neposredno sekvencirati, da ga je treba razdeliti nadrobci. Končno so bili ti fragmenti urejeni tako, da so kopijo vsakega fragmenta razgradili v še manjše enote z uporabo endonukleaz, specifičnih za sekvenco, da bi izmerili velikost vsakega majhnega fragmenta z uporabo kromatografije izključitve velikosti z uporabo teh informacij, da bi ugotovili, kje se veliki fragmenti prekrivajo drug z drugim..
Da bi ohranili elemente z njihovimi posameznimi zaporedji DNK, so bili fragmenti dodani v sistem vedno ponavljajočih se bakterijskih populacij. Klonske populacije bakterij, pri čemer vsaka populacija vzdržuje en sam umetni kromosom, so shranjene v različnih laboratorijih po vsem svetu. Umetne kromosome (BAC) je mogoče gojiti, ekstrahirati in označiti v katerem koli laboratoriju, ki vsebuje knjižnico. Genomske knjižnice so pogosto poimenovane po institucijah, kjer so bile razvite. Primer je knjižnica RPCI-11, poimenovana po Roswell Cancer Institute v Buffalu (New York, ZDA). Ti fragmenti sestavljajo približno 100 tisoč baznih parov in so osnova za večino sond FISH.
