Molekularno biološke raziskovalne metode igrajo veliko vlogo v sodobni medicini, forenziki in biologiji. Zahvaljujoč napredku pri preučevanju DNK in RNA je človek sposoben preučevati genom organizma, določiti povzročitelja bolezni, prepoznati želeno nukleinsko kislino v mešanici kislin itd.
Molekularno biološke raziskovalne metode. Kaj je?
V 70. in 80. letih prejšnjega stoletja so znanstveniki prvič uspeli razvozlati človeški genom. Ta dogodek je dal zagon razvoju genskega inženiringa in molekularne biologije. Študija lastnosti DNK in RNA je privedla do dejstva, da je zdaj mogoče uporabiti te nukleinske kisline za diagnosticiranje bolezni, preučevanje genov.
Pridobitev DNK in RNA
Molekularno-biološke diagnostične metode zahtevajo prisotnost izhodnega materiala: pogosteje so to nukleinske kisline. Obstaja več načinov za izolacijo teh snovi iz celic živih organizmov. Vsak od njih ima svoje prednosti in slabosti in je potrebenupoštevajte pri izbiri metode za izolacijo čistih nukleinskih kislin.
1. Pridobivanje DNK po Marmurju. Metoda je sestavljena iz obdelave mešanice snovi z alkoholom, zaradi česar se obori čista DNK. Pomanjkljivost te metode je uporaba agresivnih snovi: fenola in kloroforma.
2. Izolacija DNK po Boomu. Glavna uporabljena snov je gvanidin tiocianat (GuSCN). Prispeva k obarjanju deoksiribonukleinske kisline na specializiranih substratih, iz katerih se lahko nato zbere s posebnim pufrom. Vendar je GuSCN zaviralec PTC in celo majhen del tega, ki pride v oborjeno DNK, lahko vpliva na potek polimerazne verižne reakcije, ki ima pomembno vlogo pri delu z nukleinskimi kislinami.
3. Sedimentacija nečistoč. Metoda se od prejšnjih razlikuje po tem, da se ne oborijo molekule deoksiribonukleinske kisline, temveč nečistoče. Za to se uporabljajo ionski izmenjevalci. Pomanjkljivost je, da se vse snovi ne morejo oboriti.
4. Množični pregled. Ta metoda se uporablja v primerih, ko natančni podatki o sestavi molekule DNK niso potrebni, je pa treba pridobiti nekaj statističnih podatkov. To je razloženo z dejstvom, da se struktura nukleinske kisline lahko poškoduje pri obdelavi z detergenti, zlasti z alkalijami.
Klasifikacija raziskovalnih metod
Vse molekularno-biološke raziskovalne metode so razdeljene v tri velike skupine:
1. Amplifikacija (z uporabo številnih encimov). tukajse nanaša na PCR - polimerazno verižno reakcijo, ki igra veliko vlogo pri številnih diagnostičnih metodah.
2. Brez ojačevanja. Ta skupina metod je neposredno povezana z delovanjem mešanic nukleinskih kislin. Primeri so 3 bloti, hibridizacija in situ itd.
3. Metode, ki temeljijo na prepoznavanju signala iz molekule sonde, ki se veže na specifično DNK ali RNA sonde. Primer je Hybride Capture System (hc2).
Encimi, ki se lahko uporabljajo v raziskovalnih metodah molekularne biologije
Številne molekularne diagnostične metode vključujejo uporabo širokega spektra encimov. Spodaj so najpogosteje uporabljeni:
1. Restrikcijski encim - "razreže" molekulo DNK na potrebne dele.
2. DNA polimeraza - sintetizira dvoverižno molekulo deoksiribonukleinske kisline.
3. Reverzna transkriptaza (revertaza) - uporablja se za sintezo DNK na RNA predlogi.
4. DNA ligaza - odgovorna za tvorbo fosfodiesterskih vezi med nukleotidi.
5. Eksonukleaza - odstrani nukleotide iz končnih delov molekule deoksiribonukleinske kisline.
PCR je glavna metoda pomnoževanja DNK
Polimerazna verižna reakcija (PCR) se aktivno uporablja v sodobni molekularni biologiji. To je metoda, pri kateri je mogoče pridobiti ogromno kopij iz ene same molekule DNK (molekule se pomnožijo).
Glavne funkcije PCR:
- diagnostikabolezni;
- kloniranje segmentov DNK, genov.
Za izvedbo polimerazne verižne reakcije so potrebni naslednji elementi: začetna molekula DNK, termostabilna DNK polimeraza (Taq ali Pfu), deoksiribonukleotidni fosfati (viri dušikovih baz), primeri (2 primerja na 1 molekulo DNK) in sam puferski sistem, v katerem so možne vse reakcije.
PCR je sestavljen iz treh korakov: denaturacija, žarjenje temeljnega premaza in elongacija.
1. Denaturacija. Pri temperaturi 94-95 stopinj Celzija se vodikove vezi med dvema verigama DNK pretrgajo in posledično dobimo dve enoverižni molekuli.
2. Temeljno žarjenje. Pri temperaturi 50-60 stopinj Celzija so primeri pritrjeni na konce enoverižnih molekul nukleinske kisline po vrsti komplementarnosti.
3. Raztezek. Pri temperaturi 72 stopinj pride do sinteze hčerinskih dvoverižnih molekul deoksiribonukleinske kisline.
zaporedje DNK
Molekularno-biološke raziskovalne metode pogosto zahtevajo poznavanje zaporedja nukleotidov v molekuli deoksiribonukleinske kisline. Za določitev genetske kode se izvede sekvenciranje. Molekularna diagnostika prihodnosti bo temeljila na znanju, pridobljenem s človeškim zaporedjem.
Ločimo naslednje vrste zaporedja:
- Maxam-Gilbert zaporedje;
- Sanger zaporedje;
- pirosekvenciranje;
- nanoporezaporedje.
