Za razliko od evkariontov bakterije nimajo oblikovanega jedra, vendar njihova DNK ni razpršena po celici, ampak je koncentrirana v kompaktni strukturi, imenovani nukleoid. V funkcionalnem smislu je funkcionalni analog jedrskega aparata.
Kaj je nukleoid
Bakterijski nukleoid je regija v njihovih celicah, ki vsebuje strukturiran genetski material. Za razliko od evkariontskega jedra ni ločeno z membrano od ostale celične vsebine in nima trajne oblike. Kljub temu je genetski aparat bakterij jasno ločen od citoplazme.
Sam izraz pomeni "jedru podobna" ali "jedrska regija". To strukturo je leta 1890 prvič odkril zoolog Otto Buchli, vendar so bile njene razlike od genetskega aparata evkariontov odkrite že v zgodnjih petdesetih letih prejšnjega stoletja zahvaljujoč tehnologiji elektronske mikroskopije. Ime "nukleoid" ustreza pojmu "bakterijski kromosom", če je slednji vsebovan v celici v eni sami kopiji.
Nukleoid ne vključuje plazmidov, kiso ekstrakromosomski elementi bakterijskega genoma.
Lastnosti bakterijskega nukleoida
Običajno nukleoid zaseda osrednji del bakterijske celice in je usmerjen vzdolž svoje osi. Prostornina te kompaktne tvorbe ne presega 0,5 mikronov3, molekulska masa pa se giblje od 1×109 do 3×109 d alton. Na določenih točkah je nukleoid vezan na celično membrano.
Bakterijski nukleoid vsebuje tri komponente:
- DNA.
- Strukturne in regulativne beljakovine.
- RNA.
DNK ima kromosomsko organizacijo, ki se razlikuje od evkariontske. Najpogosteje bakterijski nukleoid vsebuje en kromosom ali več njegovih kopij (z aktivno rastjo njihovo število doseže 8 ali več). Ta indikator se razlikuje glede na vrsto in stopnjo življenjskega cikla mikroorganizma. Nekatere bakterije imajo več kromosomov z različnimi nabori genov.
V središču nukleoidne DNK je precej tesno zapakirana. To območje je nedostopno za ribosome, encime za replikacijo in transkripcijo. Nasprotno, deoksiribonukleinske zanke periferne regije nukleoida so v neposrednem stiku s citoplazmo in predstavljajo aktivna področja bakterijskega genoma.
Količina beljakovinske komponente v bakterijskem nukleoidu ne presega 10 %, kar je približno 5-krat manj kot v evkariontskem kromatinu. Večina beljakovin je povezanih z DNK in sodeluje pri njenem strukturiranju. RNA je produkttranskripcija bakterijskih genov, ki se izvaja na periferiji nukleoida.
Genetski aparat bakterij je dinamična tvorba, ki lahko spremeni svojo obliko in strukturno konformacijo. Manjka nukleoli in mitotični aparat, značilni za jedro evkariontske celice.
bakterijski kromosom
V večini primerov imajo bakterijski nukleoidni kromosomi zaprto obliko obroča. Linearni kromosomi so veliko manj pogosti. Vsekakor so te strukture sestavljene iz ene same molekule DNK, ki vsebuje nabor genov, potrebnih za preživetje bakterij.
Kromosomska DNK je dokončana v obliki superzvitih zank. Število zank na kromosom se giblje od 12 do 80. Vsak kromosom je popoln replikon, saj se pri podvojitvi DNK v celoti kopira. Ta proces se vedno začne od izvora replikacije (OriC), ki je pritrjen na plazemsko membrano.
Skupna dolžina molekule DNK v kromosomu je nekaj vrst velikosti večja od velikosti bakterije, zato jo je treba zapakirati, vendar ob ohranjanju funkcionalne aktivnosti.
V evkariontskem kromatinu te naloge opravljajo glavni proteini – histoni. Bakterijski nukleoid vsebuje proteine, ki vežejo DNK, ki so odgovorni za strukturno organizacijo genskega materiala in vplivajo tudi na izražanje genov in replikacijo DNK.
Proteini, povezani z nukleoidi, vključujejo:
- histonom podobni proteini HU, H-NS, FIS in IHF;
- topoizomeraze;
- proteini družine SMC.
Zadnji 2 skupini imata največji vpliv na superzvijanje genskega materiala.
Nevtralizacijo negativnih nabojev kromosomske DNK izvajajo poliamini in magnezijevi ioni.
Biološka vloga nukleoida
Najprej je nukleoid nujen za bakterije za shranjevanje in prenos dednih informacij, pa tudi za njihovo izvajanje na ravni celične sinteze. Z drugimi besedami, biološka vloga te tvorbe je enaka vlogi DNK.
Druge funkcije bakterijskih nukleoidov vključujejo:
- lokalizacija in zbijanje genskega materiala;
- funkcionalna DNK embalaža;
- regulacija presnove.
Strukturiranje DNK ne omogoča le, da se molekula prilega mikroskopski celici, ampak ustvarja tudi pogoje za normalen potek procesov replikacije in transkripcije.
Lastnosti molekularne organizacije nukleoida ustvarjajo pogoje za nadzor celičnega metabolizma s spreminjanjem konformacije DNK. Regulacija se zgodi tako, da se določene dele kromosoma izvlečejo v citoplazmo, zaradi česar so na voljo za transkripcijske encime, ali obratno, tako da jih potegnejo notri.
Metode zaznavanja
Obstajajo 3 načini za vizualno zaznavanje nukleoida v bakterijah:
- svetlobna mikroskopija;
- faznokontrastna mikroskopija;
- elektronska mikroskopija.
Odvisno od metodepriprava pripravka in raziskovalna metoda je lahko nukleoid videti drugače.
Svetlobna mikroskopija
Za odkrivanje nukleoida s svetlobnim mikroskopom se bakterije predhodno obarvajo tako, da ima nukleoid drugačno barvo od ostale celične vsebine, sicer ta struktura ne bo vidna. Obvezno je tudi fiksiranje bakterij na stekelcu (v tem primeru mikroorganizmi umrejo).
Skozi lečo svetlobnega mikroskopa je nukleoid videti kot tvorba v obliki fižola z jasnimi mejami, ki zavzema osrednji del celice.
Načini barvanja
V večini primerov se za vizualizacijo nukleoida s svetlobno mikroskopijo uporabljajo naslednje metode obarvanja bakterij:
- po Romanovsky-Giemsa;
- Felgenova metoda.
Pri barvanju po Romanovsky-Giemsi so bakterije predhodno fiksirane na stekelcu z metilnim alkoholom, nato pa jih 10-20 minut impregniramo z barvilom iz enake mešanice azurnega, eoninskega in metilensko modrega, raztopljen v metanolu. Zaradi tega nukleoid postane vijoličen, citoplazma pa bledo rožnata. Pred mikroskopijo madež odcedimo in predmetno stekelce speremo z destilatom in posušimo.
Feulgenova metoda uporablja hidrolizo s šibko kislino. Posledično sproščena deoksiriboza preide v aldehidno obliko in medsebojno deluje s fuksin-žveplovo kislino Schiffovega reagenta. Posledično nukleoid postane rdeč, citoplazma pa modra.
faznokontrastna mikroskopija
Fazna kontrastna mikroskopija imavišja ločljivost kot svetloba. Ta metoda ne zahteva fiksiranja in obarvanja pripravka - opazovanje poteka za žive bakterije. Nukleoid v takih celicah izgleda kot svetlo ovalno območje na ozadju temne citoplazme. Učinkovitejšo metodo lahko naredimo z uporabo fluorescenčnih barvil.
Odkrivanje nukleoidov z elektronskim mikroskopom
Obstajata 2 načina za pripravo pripravka za nukleoidno preiskavo pod elektronskim mikroskopom:
- ultra tanek rez;
- Izrežite zamrznjene bakterije.
Na elektronskih mikrofotografijah ultratankega dela bakterije je nukleoid videti kot gosta mrežasta struktura, sestavljena iz tankih filamentov, ki je videti lažja od okoliške citoplazme.
Na delu zamrznjene bakterije po imunskem obarvanju je nukleoid videti kot koralam podobna struktura z gostim jedrom in tankimi izrastki, ki prodirajo v citoplazmo.
Na elektronskih fotografijah nukleoid bakterij največkrat zaseda osrednji del celice in ima manjši volumen kot v živi celici. To je posledica izpostavljenosti kemikalijam, ki se uporabljajo za fiksiranje pripravka.
