Gojenje bakterij: metode, principi, koraki in pogoji

2024 Avtor: Angel Austin | [email protected]. Nazadnje spremenjeno: 2023-12-17 05:41

Mikroorganizmi v naravi okoli nas so povsod: v tleh, vodnih telesih, na površinah različnih predmetov, z njimi naseljujejo ljudi in živali. Vse to lahko služi kot vir mikrobne kontaminacije hrane, zdravil in proizvodnih linij. Gojenje bakterij je potrebno za preučevanje njihovih lastnosti, potreb in značilnosti. To pa je pomemben korak pri razvoju različnih zdravil, laboratorijski diagnostiki bolezni, izračunu proizvodnih reaktorjev in še veliko več.

Splošni koncepti

Gojenje bakterij v mikrobiologiji se nanaša na gojenje mikroorganizmov, ki se izvaja v laboratoriju. Po drugi strani se mikrobi, ki so zrasli na izbranem hranilnem mediju, imenujejo kultura. Kulture so lahko mešane, če jih tvorijo različne vrste mikroorganizmov, in čiste, če jih predstavlja samo ena vrsta bakterij.

Če je hranljivaV medij je postavljena samo ena celica in kot posledica njenega razmnoževanja se dobi skupina posameznikov, potem se ta niz mikroorganizmov imenuje klon. Ko se klon razvije do točke, ko postane viden s prostim očesom, se ta zbirka bakterij imenuje kolonija.

Običajno se gojenje bakterij, izoliranih iz različnih virov, izvaja ločeno drug od drugega. Vsaka tako ločeno gojena skupina mikrobov se imenuje sev. Torej, če je ena vrsta stafilokoka izolirana iz treh virov (ali različnih delov istega izdelka, različnih ljudi), govorijo o treh sevih te vrste stafilokoka.

Rastni dejavniki bakterij

Ti vključujejo različne aminokisline, lipide, purinske baze in druge spojine, potrebne za razvoj mikroorganizmov. Nekateri mikrobi lahko samostojno proizvajajo snovi, ki jih potrebujejo, drugi pa jih morajo prejeti v končni obliki. Glede na potrebe mikroorganizmov v določenih rastnih faktorjih se izvaja identifikacija in diferenciacija bakterij. Ta parameter je pomemben tudi za pravilno pripravo hranilnega medija za laboratorijsko in biotehnološko delo:

• aminokisline. Bakterije lahko zahtevajo eno določeno aminokislino ali skupino kislin. Torej, klostridije potrebujejo levcin in tirozin, streptokoki potrebujejo levcin in arginin. Mikroorganizmi, ki za rast potrebujejo aminokisline od zunaj, se imenujejo avksotrofi.
• Purinske in pirimidinske baze ter njihovi derivati (adenin, gvanin in drugi). So pomemben dejavnik pri rasti mnogihStreptococcus vrste.
• Vitamini. So del koencimov, ki jih potrebujejo bakterije. Torej, nikotinsko kislino, pa tudi njen amid, ki sta del NAD in NADP, potrebujejo davice in korinebakterije šigel. Tiamin kot sestavni del pirofosfata potrebujejo Staphylococcus aureus, pnevmococcus, brucella. Pantotensko kislino, ki je del koencima CoA, potrebujejo bacili tetanusa in nekatere vrste streptokokov. Citokromi in zato folna kislina, hemi in biotin, ki jih tvorijo, so potrebni za Mycobacterium tuberculosis in Haemophilus influenzae.

Okoljske zahteve

Pogoji za gojišča za gojenje bakterij:

1. Prehrana. Poleg tega morajo vsebovati snovi v lahko prebavljivi obliki, potrebne za prehranjevanje in obnavljanje energije mikroorganizmov. Ti vključujejo organogene in minerale. Nekateri mikroorganizmi poleg tega potrebujejo vitamine in aminokisline, ki jih ne morejo sintetizirati.
2. Optimalna raven pH. Vpliva na prepustnost celične membrane in s tem na sposobnost bakterije, da absorbira hranila. Najpogosteje bi morala biti pH vrednost na ravni 7, 2–7, 4. Mnogi mikroorganizmi v svojem življenju proizvajajo produkte s kislimi ali alkalnimi reakcijami, in da se pH hranilnega medija ne spreminja, mora biti medpomnjeno.
3. Izotonični. Osmotski tlak v hranilnem mediju za gojenje bakterij mora imeti enake vrednosti kotznotraj mikrobnih celic. Običajno ustreza 0,5 % raztopini NaCl.
4. Sterilnost. To je posledica dejstva, da bo pojav tujih bakterij izkrivljal rezultate študije analiziranega seva.
5. Raven vlažnosti. Ta indikator bi moral skupaj s konsistenco medija imeti optimalne lastnosti za določeno vrsto bakterij.
6. Redoks potencial (RH2). Prikazuje razmerje med snovmi, ki darujejo in sprejemajo elektrone, pa tudi stopnjo nasičenosti hranilnega medija s kisikom. Pri aerobi in anaerobi se pogoji za gojenje bakterij v tem kazalcu nekoliko razlikujejo. Anaerobni mikroorganizmi se najbolje razmnožujejo pri vrednostih RH2 pod 5, aerobni mikroorganizmi pa najmanj 10.
7. Poenotenost. Pomembno je, da gojišče vsebuje konstantne količine svojih posameznih sestavin. Poleg tega imajo prednost jasne rešitve, ki olajšajo spremljanje rasti pridelka ali opazijo kontaminacijo.

Vrste kulturnih medijev

Na izbiro posameznega gojišča za gojenje mikroorganizmov vpliva veliko dejavnikov, med katerimi so značilnosti njihove prehrane in namen študije. Glavne značilnosti, na katerih temelji klasifikacija hranilnih medijev, so:

1. Komponente. Glede na začetne snovi, uporabljene za izdelavo substrata, razlikujejo:

• naravni, ki so pripravljeni iz proizvodov živalskega ali rastlinskega izvora (npr. meso, mleko, sadje) in so primerni za gojenje mešanihpridelki;
• polsintetični, pri katerem drage naravne živilske izdelke nadomestijo neprehrambeni izdelki (na primer kostna moka, krvni strdki) in so optimalni za gojenje določenih vrst bakterij ali izolacijo njihovih presnovnih produktov iz okolje;
• sintetični, ki so pripravljeni iz natančnih količin kemičnih spojin, imajo znano konstantno sestavo in jih je enostavno ponovljivo.

2. Konzistentnost (gostota). Razlikovanje okolij:

• tekočina;
• gosto;
• poltekoč.

Zadnja dva sta pripravljena iz posebnih raztopin ali tekočih snovi z dodatkom agar-agarja ali želatine za ustvarjanje zahtevane gostote. Poleg tega je gosto okolje za rast bakterij strjen krvni serum, krompir, medij silikagela, karagenan.

3. Sestavljen. Na podlagi tega so okolja:

• simple, katerega seznam je kratek, je mesna peptonska juha (MBB), juha in agar Hottinger, mesni peptonski agar (MPA), hranilna želatina in peptonska voda.
• kompleksno, pripravljeno iz preprostih z dodatkom krvi, sirotke, ogljikovih hidratov in drugih snovi.

4. Imenovanje. Razlikujejo se naslednji hranilni mediji:

• main se uporabljajo za gojenje številnih patogenih mikrobov (običajno preprosta sestava);
• posebne se uporabljajo za izolacijo in gojenje bakterij, ki ne rastejo na preprostih substratih;
• selektivni (so tudi selektivni) so primerni za izolacijo določene vrste bakterij in zavirajo rast povezanih mikrobov (selektivnostnastala z dodajanjem določenih snovi v medije, kot so antibiotiki ali soli, ali s prilagajanjem pH);
• diferencialna diagnostika omogoča razlikovanje ene vrste bakterij od druge z oceno encimske aktivnosti, na primer medija;
• za začetno inokulacijo z naknadnim transportom vzorcev so potrebni konzervansi, saj preprečujejo smrt mikroorganizmov in zavirajo rast drugih bakterij.

Priprava medija

Najpomembnejši korak pri gojenju anaerobnih bakterij je priprava ustreznega hranilnega medija. Ko so izbrani optimalni parametri, nadaljujte z naslednjimi koraki:

• tehtanje, z izbiro vzorca komponent na analitski tehtnici;
• raztapljanje poteka v destilirani vodi, segreti na 70 °C, in fosfati, mikro- in makrosoli se raztopijo ločeno;
• v vodni kopeli dve minuti;
• določanje pH z indikatorskim papirjem ali potenciometrom;
• filtracija skozi mokro krpo ali papirnate filtre za tekoče in staljene goste medije ter skozi filter iz bombažne gaze za agar medij;
• polnjenje opravljeno na 3/4 kapacitete;
• srednje odvisna sterilizacija;
• kontrolo sterilnosti izvedemo tako, da dva dni stanemo v termostatu, čemur sledi ogled;
• kemični nadzor za določitev pH in vsebnosti potrebnegapredmeti;
• biološki nadzor s poskusno inokulacijo.

Sterilizacija steklene posode in medijev

Eno od osnovnih načel gojenja bakterij je sterilnost. Rast in razvoj tujih mikroorganizmov lahko vpliva na lastnosti hranilnega medija s spreminjanjem njegove kemične sestave in pH. Sterilizacija je glavni pogoj za gojenje čistih kultur. V praksi ta izraz pomeni metode uničenja absolutno vseh življenjskih oblik na površini in v prostornini steriliziranih predmetov. Posode, uporabljeni instrumenti, mediji in drugi predmeti, uporabljeni med študijo, so sterilizirani.

Nekatere vrste sterilizacije:

• Vžig. Sterilizacija zank in igel za sejanje, stekelca, nekaterih instrumentov se lahko izvede z gorilnikom ali špirito.
• Vrenje. Primerno za rokovanje z brizgami, iglami, hrano, vendar ne ubija bakterijskih spor.
• Sterilizacija s suho toploto. Izvaja se v posebni sušilni omari in je primerna za obdelavo bučk, epruvet in druge laboratorijske steklene posode.
• Sterilizacija s paro. Ta metoda, ki se izvaja v avtoklavu, je zelo učinkovita. Ni pa primeren za hranilne medije, ki vsebujejo beljakovine ali druge spojine, ki se razgradijo pri visokih temperaturah. Bolj varčevanju lahko rečemo tindalizacija. Izvaja se v Kochovem kotlu in združuje kalitev spor z njihovim uničenjem.
• Pasterizacija. Uporablja se za medije, ki pri vrenju spremenijo svoje lastnosti (na primer mleko, vino, pivo), ki lahkojih znebite mikroorganizmov, ki ne nosijo spor. Temperatura obdelave je le 50-60 ° C za petnajst do trideset minut. V nekaterih primerih se uporablja hladna sterilizacija, ki se izvaja s filtri ali UV žarki.

pogoji za gojenje bakterij

Rast in razvoj bakterij je mogoča le pod določenimi dejavniki in vrednostmi vsakega od njih:

1. Temperatura. Obstajajo tri skupine bakterij, ki se razlikujejo glede na temperaturne nastavitve:

• termofili ali mikrobi, ki ljubijo toploto, rastejo pri 45-90°C, kar pomeni, da se ne razmnožujejo v človeških in živalskih organizmih;
• psihrofili ali hladno ljubeči mikroorganizmi imajo raje temperature v območju 5-15 °C in se gojijo v hladilnicah;
• mezofili, se razvijejo pri temperaturi 25-37 °C, vključujejo večino bakterij.

2. Svetloba. To je značilnost gojenja fototrofnih bakterij, saj izvajajo fotosintetski proces. Toda za večino mikrobov osvetlitev ni pogoj. In celo obratno, sončni ultravijolični žarki lahko zavirajo njihov razvoj.

3. Voda. Vsi mikroorganizmi potrebujejo vodo v dostopni (tekoči) obliki. Zato zamrznjena hrana malo ali nič ne raste bakterij.

4. Zakisanost okolja. To načelo gojenja bakterij je bilo že podrobno obravnavano zgoraj.

5. Prezračevanje. Kisik je kot kemični element sestavni del vode in precejšnjega števila spojin, za katere se uporabljagojenje mikroorganizmov. Plinasti kisik se lahko nahaja tudi v vodi in drugih tekočinah v raztopljeni obliki. Pomemben del bakterij potrebuje stalno oskrbo z molekulami kisika. Toda za številne mikroorganizme je to nepotrebno ali, še huje, plinasti kisik je strupen zanje, saj nimajo katalaze in peroksidaze, ki uničujeta strupene produkte dihal. Zato je najpomembnejši korak pri gojenju anaerobnih bakterij odstranitev molekul O₂ iz hranilnega medija.

6. Gojenje mikroorganizmov. Gojenje aerobnih in anaerobnih bakterij poteka v različnih plasteh okolja in na različne načine.

Gojenje aerobnih mikroorganizmov

Gojenje aerobnih bakterij zahteva molekularni kisik. Za pridobivanje čistih kultur aerobov, ki se lahko uspešno uporabljajo v medicini in živilski industriji, se uporabljajo naslednje metode:

• površina, ki raste na gostih medijih ali v tekočih medijih (njihova tanka plast), ko kisik prihaja neposredno iz zraka;
• globoka kultivacija v tekočih medijih, ko se s stalnim prezračevanjem doseže povečanje količine kisika, raztopljenega v njih.

Gojenje anaerobnih mikroorganizmov

Osnovno načelo gojenja bakterij te vrste je njihov minimalen stik z atmosferskim kisikom. Zagotavljanje pogojev za njihovo rast je veliko težje kot za aerobe. Naslednje metode se uporabljajo za izolacijo anaerobov iz molekularnega O₂:

1. fizično. Ta način gojenja anaerobnih bakterij se zmanjša na njihovo gojenje v posebnem vakuumskem aparatu - mikroanaerostatu. Zrak v njem nadomesti posebna plinska mešanica dušika z dodatkom 10 % vodika in 5 % ogljikovega dioksida.
2. Kemična. Ti vključujejo: uporabo vpojnih sredstev (npr. Fe, Na₂S₂O₄, CuCl) ali reduktorji (kot je askorbinska kislina).
3. biološki. Gre za skupno gojenje aerobov in anaerobov v zaprtem sistemu. Ta metoda gojenja bakterij vključuje polovico petrijevke zasaditev z nekaterimi aerobnimi vrstami bakterij, drugo polovico pa s preučevanim anaerobom. Njegov razvoj se bo začel v trenutku, ko bo porabljen ves kisik.

Naslednje metode setve so primerne za gojenje anaerobnih bakterij:

• v površinski plasti;
• v površinski plasti, napolnjeni s sterilnim parafinom;
• v debelini gostega hranilnega medija;
• v globokih plasteh viskoznih medijev.

Pridobitev čiste kulture

Mikrobiologi običajno delajo z vzorci, v katerih živi veliko različnih vrst mikrobov. Vendar pa je za določitev sistematičnega položaja mikroorganizmov (družina, rod, vrsta), pa tudi za preučevanje njihovih značilnosti, jih treba izolirati in gojiti čisto kulturo. Imajo velik pomen v številnih živilskih industrijah, na primer sir, kruh, kvas, vino itd. Gojenje mlečnokislinskih bakterij omogoča pridobivanjebistvena sestavina za proizvodnjo fermentiranih mlečnih izdelkov, testa, kakava, silaže in celo plastike.

Metoda izolacije čiste kulture v gostem mediju temelji na mehanskem ločevanju celic mikroorganizmov z njihovo naknadno izolirano kultivacijo. Vzorec prestavimo v sterilno količino vode ali fiziološke raztopine (volumen 10-100 ml) in nato stresamo dve minuti. Za ekstrakcijo mikroorganizmov, ki se nahajajo v debelini preučevanega materiala (na primer klobase ali sir), najprej izvedemo drgnjenje kosov vzorca s sterilnimi instrumenti s peskom. Material, ki je bil predhodno pripravljen, težki 1 g ali volumna 1 ml, se razredči s sterilno vodo za 10, 100, 1000 itd. krat. Izbere se stopnja redčenja, ki daje koncentracijo celic, ki ustreza zmožnostim metode.

Naslednje gojenje mikroorganizmov je priprava hranilnega medija. Običajno se izbere gosto medij (MPA). Najprej ga stopimo in ohladimo na 45-50 °C, šele nato ga vlijemo v več petrijevk (tri do pet kosov), na dno katerih naložimo brise iz testne snovi različnih koncentracij. Nato se izvede mešanje še nezamrznjenega hranilnega medija in vanj vnesenega materiala. Tako so celice pritrjene na različnih točkah volumna substrata.

Nato petrijevke postavimo v termostat za 2 dni pri 22 °C. V tem času se celice namnožijo do te mere, da kolonija, ki jo tvori vsaka od celic, postane vidna s prostim očesom. Vsaka od njih je čista kultura tiste vrste bakterije, iz katere celice jevrtnica.

Po tem iz petrijevk mikroorganizme subkultiramo v ločene epruvete, napolnjene s hranilnim medijem. Na ta način se čiste kulture izolirajo iz mešanega vzorca. Ta metoda nosi ime svojega razvijalca - R. Koch. Običajno jo imenujemo tudi metoda skodelice ali izčrpna setev. Po pridobitvi čistih kultur različnih vrst bakterij se določi njihova oblika, spore in družine.

Vsa dela morajo biti opravljena v skladu z načeli asepse. Da bi preprečili prezgodnji razvoj mikroorganizmov, je treba študijo izvesti takoj po vzorčenju. Vodo iz pipe analiziramo po odvajanju prvih porcij, saj lahko vsebujejo mikrobe, ki so se nabrali v ceveh in pipah. Mikroflora sadja, jagodičja in zelenjave se nahaja predvsem na površini (lupini), zato se iz nje izvajajo umivanja. Če želite to narediti, postavite plod v sterilno posodo in ga napolnite z potrebno količino vode. Nato jih precej močno stresemo in vodo prelijemo v drugo posodo. Pridelke iz izdelkov iz blaga pridobivamo tudi v brisih, vendar se pred tem iz njih izrežejo kosi določene velikosti.