Absorpcija in nadaljnja ponovna emisija svetlobe z anorganskimi in organskimi mediji je posledica fosforescence ali fluorescence. Razlika med pojavoma je dolžina intervala med absorpcijo svetlobe in oddajanjem toka. Pri fluorescenci ti procesi potekajo skoraj istočasno, pri fosforescenci pa z nekaj zamude.
Zgodovinsko ozadje
Leta 1852 je britanski znanstvenik Stokes prvič opisal fluorescenco. Nov izraz je skoval kot rezultat svojih poskusov s fluorom, ki je oddajal rdečo svetlobo, ko je bil izpostavljen ultravijolični svetlobi. Stokes je opazil zanimiv pojav. Ugotovil je, da je valovna dolžina fluorescenčne svetlobe vedno daljša od valovne dolžine vzbujevalne svetlobe.
Veliko poskusov je bilo izvedenih v 19. stoletju, da bi potrdili hipotezo. Pokazali so, da različni vzorci fluorescirajo, ko so izpostavljeni ultravijolični svetlobi. Materiali so med drugim vključevali kristale, smole, minerale, klorofil,zdravilne surovine, anorganske spojine, vitamini, olja. Neposredna uporaba barvil za biološke analize se je začela šele leta 1930
Opis fluorescenčne mikroskopije
Nekateri materiali, uporabljeni v raziskavah v prvi polovici 20. stoletja, so bili zelo specifični. Zahvaljujoč indikatorjem, ki jih s kontrastnimi metodami ni bilo mogoče doseči, je metoda fluorescenčne mikroskopije postala pomembno orodje tako v biomedicinskih kot bioloških raziskavah. Dobljeni rezultati so bili za znanost o materialih zelo pomembni.
Kakšne so prednosti fluorescenčne mikroskopije? S pomočjo novih materialov je postalo mogoče izolirati zelo specifične celice in submikroskopske komponente. Fluorescenčni mikroskop vam omogoča odkrivanje posameznih molekul. Različne barve vam omogočajo identifikacijo več elementov hkrati. Čeprav je prostorska ločljivost opreme omejena z mejo difrakcije, ki pa je odvisna od specifičnih lastnosti vzorca, je tudi detekcija molekul pod to ravnjo povsem možna. Različni vzorci po obsevanju kažejo avtofluorescenco. Ta pojav se pogosto uporablja v petrologiji, botaniki, polprevodniški industriji.
Funkcije
Študija živalskih tkiv ali patogenih mikroorganizmov je pogosto zapletena zaradi prešibke ali zelo močne nespecifične avtofluorescence. Vendar pa je vrednost vraziskave pridobijo vnašanje v material komponent, ki se vzbujajo na določeni valovni dolžini in oddajajo svetlobni tok zahtevane jakosti. Fluorokromi delujejo kot barvila, ki se lahko samo pritrdijo na strukture (nevidne ali vidne). Hkrati jih odlikuje visoka selektivnost glede na cilje in kvantni izkoristek.
Fluorescenčna mikroskopija se je široko uporabljala s prihodom naravnih in sintetičnih barvil. Imeli so specifične profile intenzivnosti emisij in vzbujanja in so bili usmerjeni v specifične biološke cilje.
Identifikacija posameznih molekul
Pogosto lahko v idealnih pogojih registrirate sijaj enega samega elementa. Za to je med drugim treba zagotoviti dovolj nizek šum detektorja in optično ozadje. Molekula fluoresceina lahko oddaja do 300.000 fotonov pred uničenjem zaradi fotobeljenja. Z 20-odstotno stopnjo zbiranja in učinkovitostjo procesa jih je mogoče registrirati v višini približno 60 tisoč
Fluorescenčna mikroskopija, ki temelji na plazovitih fotodiodah ali množenju elektronov, je raziskovalcem omogočila opazovanje obnašanja posameznih molekul za sekunde, v nekaterih primerih pa tudi minute.
Težave
Ključna težava je zatiranje šuma iz optičnega ozadja. Ker številni materiali, uporabljeni pri izdelavi filtrov in leč, kažejo nekaj avtofluorescence, so bila prizadevanja znanstvenikov v začetnih fazah usmerjena v izdajokomponente z nizko fluorescenco. Vendar so kasnejši poskusi pripeljali do novih zaključkov. Zlasti je bilo ugotovljeno, da fluorescenčna mikroskopija, ki temelji na popolnem notranjem odboju, doseže nizko ozadje in visoko ekscitacijsko svetlobno moč.
mehanizem
Načela fluorescenčne mikroskopije, ki temeljijo na popolni notranji refleksiji, so uporaba hitro razpadajočega ali nerazširljivega vala. Nastane na vmesniku med mediji z različnimi lomnimi indeksi. V tem primeru gre svetlobni žarek skozi prizmo. Ima visok lomni količnik.
Prizma je poleg vodne raztopine ali stekla z nizkimi parametri. Če je snop svetlobe usmerjen nanj pod kotom, ki je večji od kritičnega, se žarek popolnoma odbije od vmesnika. Ta pojav pa povzroči neširjenje vala. Z drugimi besedami, nastane elektromagnetno polje, ki prodre v medij z nižjim lomnim količnikom na razdalji manj kot 200 nanometrov.
V nerazširjajočem se valu bo intenzivnost svetlobe povsem zadostovala za vzbujanje fluoroforjev. Vendar bo zaradi izjemno majhne globine njegova prostornina zelo majhna. Rezultat je nizko ozadje.
Sprememba
Fluorescenčna mikroskopija, ki temelji na popolni notranji refleksiji, se lahko izvede z epi-osvetlitvijo. To zahteva leče s povečano številčno zaslonko (vsaj 1,4, vendar je zaželeno, da doseže 1,45-1,6), pa tudi delno osvetljeno polje aparata. Slednje se doseže z majhnim mestom. Za večjo enotnost se uporablja tanek obroč, skozi katerega se blokira del toka. Za pridobitev kritičnega kota, po katerem pride do popolnega odboja, je potrebna visoka stopnja loma potopnega medija v lečah in pokrovnem steklu mikroskopa.
