Beljakovine so bistvena sestavina vseh organizmov. Vsaka od njegovih molekul je sestavljena iz ene ali več polipeptidnih verig, sestavljenih iz aminokislin. Čeprav so informacije, potrebne za življenje, kodirane v DNK ali RNA, rekombinantne beljakovine opravljajo širok spekter bioloških funkcij v organizmih, vključno z encimsko katalizo, zaščito, podporo, gibanje in regulacijo. Glede na njihove funkcije v telesu lahko te snovi razdelimo v različne kategorije, kot so protitelesa, encimi, strukturna komponenta. Glede na njihove pomembne funkcije so bile takšne spojine intenzivno proučevane in široko uporabljene.
V preteklosti je bil glavni način pridobivanja rekombinantnega proteina izolacija iz naravnega vira, kar je običajno neučinkovito in dolgotrajno. Nedavni napredek v biološki molekularni tehnologiji je omogočil kloniranje DNK, ki kodira določen niz snovi, v ekspresijski vektor za snovi, kot so bakterije, kvasovke, celice žuželk in celice sesalcev.
Preprosto povedano, rekombinantne beljakovine prevedejo eksogeni produkti DNK vžive celice. Njihovo pridobivanje običajno vključuje dva glavna koraka:
- Kloniranje molekule.
- Izraz beljakovin.
Trenutno je izdelava takšne strukture ena najmočnejših metod v medicini in biologiji. Sestava ima široko uporabo v raziskavah in biotehnologiji.
Medicinska smer
Rekombinantni proteini zagotavljajo pomembno zdravljenje različnih bolezni, kot so sladkorna bolezen, rak, nalezljive bolezni, hemofilija in anemija. Tipične formulacije takšnih snovi vključujejo protitelesa, hormone, interlevkine, encime in antikoagulante. Vse več je potrebe po rekombinantnih formulacijah za terapevtsko uporabo. Omogočajo vam razširitev metod zdravljenja.
gensko spremenjeni rekombinantni proteini igrajo ključno vlogo na trgu terapevtskih zdravil. Celice sesalcev trenutno proizvajajo največ zdravilnih učinkovin, ker so njihove formulacije sposobne proizvajati visokokakovostne naravne snovi. Poleg tega se v E. coli zaradi dobre genetike, hitre rasti in visoke produktivnosti proizvaja veliko odobrenih rekombinantnih terapevtskih proteinov. Pozitivno vpliva tudi na razvoj zdravil na osnovi te snovi.
Raziskava
Pridobivanje rekombinantnih beljakovin temelji na različnih metodah. Snovi pomagajo ugotoviti osnovna in temeljna načela telesa. Te molekule je mogoče uporabiti za identifikacijo in določanjelokacijo snovi, ki jo kodira določen gen, in razkriti delovanje drugih genov pri različnih celičnih aktivnostih, kot so celična signalizacija, presnova, rast, replikacija in smrt, transkripcija, prevod in modifikacija spojin, obravnavanih v članku.
Tako se opazovana sestava pogosto uporablja v molekularni biologiji, celični biologiji, biokemiji, strukturnih in biofizikalnih študijah in mnogih drugih področjih znanosti. Hkrati je pridobivanje rekombinantnih beljakovin mednarodna praksa.
Takšne spojine so uporabna orodja pri razumevanju medceličnih interakcij. Izkazali so se za učinkovite pri več laboratorijskih metodah, kot sta ELISA in imunohistokemija (IHC). Rekombinantne beljakovine se lahko uporabijo za razvoj encimskih testov. Če se uporabljajo v kombinaciji s parom ustreznih protiteles, se lahko celice uporabljajo kot standardi za nove tehnologije.
biotehnologija
Rekombinantni proteini, ki vsebujejo zaporedje aminokislin, se uporabljajo tudi v industriji, proizvodnji hrane, kmetijstvu in bioinženiringu. Na primer, v živinoreji se lahko hrani dodajajo encimi za povečanje hranilne vrednosti krmnih sestavin, zmanjšanje stroškov in odpadkov, podporo zdravju črevesja živali, izboljšanje produktivnosti in izboljšanje okolja.
Poleg tega mlečnokislinske bakterije (LAB) za dolgo časaso bili uporabljeni za proizvodnjo fermentiranih živil, pred kratkim pa je bil LAB razvit za izražanje rekombinantnih beljakovin, ki vsebujejo zaporedje aminokislin, ki se lahko široko uporabljajo, na primer za izboljšanje prebave pri ljudeh, živalih in hrani.
Vendar imajo te snovi tudi omejitve:
- V nekaterih primerih je proizvodnja rekombinantnih beljakovin zapletena, draga in dolgotrajna.
- Snovi, proizvedene v celicah, se morda ne ujemajo z naravnimi oblikami. Ta razlika lahko zmanjša učinkovitost terapevtskih rekombinantnih beljakovin in celo povzroči neželene učinke. Poleg tega lahko ta razlika vpliva na rezultate poskusov.
- Glavni problem vseh rekombinantnih zdravil je imunogenost. Vsi biotehnološki izdelki lahko kažejo neko obliko imunogenosti. Težko je predvideti varnost novih terapevtskih beljakovin.
Na splošno se je napredek biotehnologije povečal in olajšal proizvodnjo rekombinantnih beljakovin za različne aplikacije. Čeprav imajo še vedno nekaj pomanjkljivosti, so snovi pomembne v medicini, raziskavah in biotehnologiji.
povezava do bolezni
rekombinantni protein ni škodljiv za ljudi. Je le sestavni del celotne molekule pri razvoju določenega zdravila ali prehranskega elementa. Številne medicinske študije so pokazale, da je prisilno izražanje proteina FGFBP3 (skrajšano BP3) v laboratorijskem sevu debelih miši pokazalo znatno zmanjšanje njihove telesne maščobe.mase, kljub genetski nagnjenosti k uporabi.
Rezultati teh preskušanj kažejo, da lahko protein FGFBP3 ponudi novo zdravljenje za motnje, povezane s presnovnim sindromom, kot sta sladkorna bolezen tipa 2 in bolezen maščobnih jeter. Ker pa je BP3 naravna beljakovina in ne umetno zdravilo, bi se lahko klinična preskušanja rekombinantnega človeškega BP3 začela po zadnjem krogu predkliničnih študij. Na, torej, obstajajo razlogi, povezani z varnostjo izvajanja takšnih študij. Rekombinantna beljakovina ni škodljiva za ljudi zaradi postopne obdelave in čiščenja. Spremembe se dogajajo tudi na molekularni ravni.
PD-L2, eden ključnih akterjev v imunoterapiji, je bil leta 2018 nominiran za Nobelovo nagrado za fiziologijo ali medicino. To delo, ki sta ga začela prof. James P. Allison iz ZDA in prof. Tasuku Honjo iz Japonske, je privedlo do zdravljenja rakavih obolenj, kot so melanom, pljučni rak in drugi, ki temeljijo na imunoterapiji kontrolnih točk. Nedavno je AMSBIO v svojo linijo imunoterapije dodal pomemben nov izdelek, aktivator PD-L2/TCR - CHO rekombinantna celična linija.
Pri poskusih dokazovanja koncepta so raziskovalci na Univerzi v Alabami v Birminghamu, ki jih vodi H. Long Zheng, MD, profesor Robert B. Adams, in direktor laboratorijske medicine, Oddelek za patologijo, UAB School of Medicina, so izpostavili potencialno zdravljenje redke, a usodne motnje krvavitve, TTP.
Rezultati tegaštudije prvič kažejo, da je transfuzija trombocitov, napolnjenih z rADAMTS13, lahko nov in potencialno učinkovit terapevtski pristop za arterijsko trombozo, povezano s prirojeno in imunsko posredovano TTP.
Rekombinantni protein ni le hranilo, ampak tudi zdravilo v sestavi zdravila, ki se razvija. To je le nekaj področij, ki so zdaj vključena v medicino in so povezana s preučevanjem vseh njenih strukturnih elementov. Kot kaže mednarodna praksa, struktura snovi omogoča reševanje številnih resnih težav v človeškem telesu na molekularni ravni.
Razvoj cepiva
Rekombinantni protein je specifičen niz molekul, ki jih je mogoče modelirati. Podobna lastnost se uporablja pri razvoju cepiv. Nova strategija cepljenja, znana tudi kot uporaba posebne injekcije rekombinantnega virusa, bi lahko zaščitila milijone piščancev, ogroženih zaradi resne bolezni dihal, so povedali raziskovalci z univerze v Edinburghu in inštituta Pirbright. Ta cepiva uporabljajo neškodljive ali šibke različice virusa ali bakterije za vnos klic v telesne celice. V tem primeru so strokovnjaki uporabili rekombinantne viruse z različnimi spike proteini kot cepiva za ustvarjanje dveh različic neškodljivega virusa. Na tej povezavi je zgrajenih veliko različnih zdravil.
Trgovska imena in analogi rekombinantnih beljakovin so naslednja:
- "Fortelizin".
- "Z altrap".
- "Eylea".
To so predvsem zdravila proti raku, vendar so s to učinkovino povezana še druga področja zdravljenja.
Novo cepivo, imenovano tudi LASSARAB, namenjeno zaščiti ljudi pred mrzlico Lassa in steklino, je pokazalo obetavne rezultate v predkliničnih študijah, je pokazala nova študija, objavljena v znanstveni reviji Nature Communications. Kandidat za inaktivirano rekombinantno cepivo uporablja oslabljen virus stekline.
Raziskovalna skupina je vstavila genski material virusa Lassa v vektor virusa stekline, tako da bi cepivo izražalo površinske beljakovine tako v celicah Lassa kot v celicah stekline. Te površinske spojine izzovejo imunski odziv proti povzročiteljem okužb. To cepivo je bilo nato inaktivirano, da bi "uničili" živi virus stekline, ki je bil uporabljen za izdelavo nosilca.
Način pridobivanja
Obstaja več sistemov za proizvodnjo snovi. Splošna metoda za pridobivanje rekombinantnega proteina temelji na pridobivanju biološkega materiala iz sinteze. Ampak obstajajo tudi drugi načini.
Trenutno obstaja pet glavnih izraznih sistemov:
- Ekspresijski sistem E. coli.
- Sistem izražanja kvasovk.
- Sistem izražanja celic žuželk.
- Sistem izražanja celic sesalcev.
- Sistem izražanja beljakovin brez celic.
Zadnja možnost je še posebej primerna za izražanje transmembranskih proteinovin strupene spojine. V zadnjih letih se v celice in vitro uspešno vgrajujejo snovi, ki jih je težko izražati z običajnimi intracelularnimi metodami. V Belorusiji se široko uporablja proizvodnja rekombinantnih beljakovin. S tem vprašanjem se ukvarjajo številna podjetja v državni lasti.
Cell Free Protein Synthesis System je hitra in učinkovita metoda za sintezo ciljnih snovi z dodajanjem različnih substratov in energijskih spojin, potrebnih za transkripcijo in translacijo v encimskem sistemu celičnih izvlečkov. V zadnjih letih so se postopoma pojavile prednosti metod brez celic za vrste snovi, kot so kompleksne, toksične membrane, kar dokazuje njihovo potencialno uporabo na biofarmacevtskem področju.
Tehnologija brez celic lahko preprosto in nadzorovano doda različne nenaravne aminokisline, da doseže zapletene procese modifikacije, ki jih je težko razrešiti po običajni rekombinantni ekspresiji. Takšne metode imajo visoko uporabno vrednost in potencial za dostavo zdravil in razvoj cepiva z uporabo virusom podobnih delcev. Veliko število membranskih beljakovin je bilo uspešno izraženo v prostih celicah.
Izraz skladb
Rekombinantni protein CFP10-ESAT 6 se proizvaja in uporablja za izdelavo cepiv. Takšen alergen tuberkuloze vam omogoča krepitev imunskega sistema in razvoj protiteles. Na splošno molekularne študije vključujejo preučevanje katerega koli vidika beljakovine, kot so struktura, funkcija, modifikacije, lokalizacija ali interakcije. RaziskovatiKako posebne snovi uravnavajo notranje procese, raziskovalci običajno potrebujejo sredstva za proizvodnjo funkcionalnih spojin, ki so zanimive in koristne.
Glede na velikost in kompleksnost beljakovin kemična sinteza ni izvedljiva možnost za to prizadevanje. Namesto tega se žive celice in njihovi celični stroji običajno uporabljajo kot tovarne za ustvarjanje in konstruiranje snovi na podlagi priloženih genetskih predlog. Sistem ekspresije rekombinantnih beljakovin nato ustvari potrebno strukturo za ustvarjanje zdravila. Sledi izbor potrebnega materiala za različne kategorije zdravil.
Za razliko od beljakovin je DNK enostavno zgraditi sintetično ali in vitro z uporabo dobro uveljavljenih rekombinantnih tehnik. Zato lahko DNK predloge specifičnih genov, z dodanimi reporterskimi sekvencami ali zaporedji afinitetnih oznak ali brez njih, oblikujemo kot predloge za izražanje spremljane snovi. Takšne spojine, ki izhajajo iz takšnih DNK predlog, se imenujejo rekombinantni proteini.
Tradicionalne strategije za izražanje snovi vključujejo transfekcijo celic z vektorjem DNK, ki vsebuje predlogo, in nato gojenje celic za prepisovanje in prevajanje želene beljakovine. Običajno celice nato liziramo, da ekstrahiramo izraženo spojino za naknadno čiščenje. Rekombinantni protein CFP10-ESAT6 je obdelan na ta način in gre skozi sistem čiščenja od možnihnastajanje toksinov. Šele nato gre sintetizirati v cepivo.
Prokariontski in evkariontski in vivo ekspresijski sistemi za molekularne snovi se pogosto uporabljajo. Izbira sistema je odvisna od vrste beljakovin, zahtev po funkcionalni aktivnosti in želenega donosa. Ti ekspresijski sistemi vključujejo sesalce, žuželke, kvasovke, bakterije, alge in celice. Vsak sistem ima svoje prednosti in izzive, zato je izbira pravega sistema za določeno uporabo pomembna za uspešno izražanje snovi, ki se pregleduje.
Izraz iz sesalcev
Uporaba rekombinantnih beljakovin omogoča razvoj cepiv in zdravil različnih ravni. Za to se lahko uporabi ta način pridobivanja snovi. Ekspresijske sisteme sesalcev je mogoče uporabiti za proizvodnjo beljakovin iz živalskega kraljestva, ki imajo zaradi svojega fiziološko pomembnega okolja najbolj naravno strukturo in aktivnost. To ima za posledico visoko raven post-translacijske obdelave in funkcionalne aktivnosti. Ekspresijske sisteme pri sesalcih je mogoče uporabiti za proizvodnjo protiteles, kompleksnih proteinov in spojin za uporabo v funkcionalnih testih na osnovi celic. Vendar pa so te prednosti povezane s strožjimi pogoji kulture.
Ekspresijski sistemi sesalcev se lahko uporabljajo za tvorbo proteinov prehodno ali prek stabilnih celičnih linij, kjer je ekspresijski konstrukt integriran v gostiteljski genom. Medtem ko se takšni sistemi lahko uporabljajo v več poskusih, časproizvodnja lahko ustvari veliko količino snovi v enem do dveh tednih. Ta vrsta biotehnologije rekombinantnih beljakovin je zelo povpraševana.
Ti prehodni, visoko donosni ekspresijski sistemi pri sesalcih uporabljajo suspenzijske kulture in lahko dajejo gramov na liter. Poleg tega imajo ti proteini v primerjavi z drugimi ekspresijskimi sistemi več nativnega zlaganja in post-translacijskih modifikacij, kot je glikozilacija.
Izraz žuželk
Metode za proizvodnjo rekombinantnih beljakovin niso omejene na sesalce. Obstajajo tudi bolj produktivni načini glede proizvodnih stroškov, čeprav je izkoristek snovi na 1 liter obdelane tekočine precej nižji.
Celice žuželk se lahko uporabijo za izražanje beljakovin na visoki ravni z modifikacijami, podobnimi sistemom sesalcev. Obstaja več sistemov, ki jih je mogoče uporabiti za ustvarjanje rekombinantnega bakulovirusa, ki se nato lahko uporabi za ekstrakcijo snovi, ki nas zanima, v celicah žuželk.
Izraze rekombinantnih beljakovin je mogoče enostavno povečati in prilagoditi suspenzijski kulturi visoke gostote za obsežno sestavljanje molekul. Funkcionalno so bolj podobni naravni sestavi snovi sesalcev. Čeprav je donos lahko do 500 mg/L, je proizvodnja rekombinantnega bakulovirusa lahko dolgotrajna in pogoji gojenja so težji kot prokariontski sistemi. Vendar v bolj južnih in toplejših državah podobnometoda velja za učinkovitejšo.
Bakterijski izraz
Proizvodnjo rekombinantnih beljakovin je mogoče vzpostaviti s pomočjo bakterij. Ta tehnologija se bistveno razlikuje od zgoraj opisanih. Sistemi za ekspresijo bakterijskih beljakovin so priljubljeni, ker je bakterije enostavno gojiti, hitro rastejo in dajejo visoke donose rekombinantne formulacije. Vendar pa so večdomenske evkariontske snovi, izražene v bakterijah, pogosto nefunkcionalne, ker celice niso opremljene za izvajanje potrebnih posttranslacijskih modifikacij ali molekularnega zlaganja.
Poleg tega mnoge beljakovine postanejo netopne kot inkluzijske molekule, ki jih je zelo težko obnoviti brez močnih denaturatorjev in kasnejših okornih postopkov molekularnega ponovnega zlaganja. Ta metoda se večinoma šteje za še vedno večinoma eksperimentalno.
prosto izražanje celic
Rekombinantni protein, ki vsebuje aminokislinsko zaporedje stafilokinaze, je pridobljen na nekoliko drugačen način. Vključen je v številne vrste injekcij, ki zahtevajo več sistemov pred uporabo.
Izražanje beljakovin brez celic je in vitro sinteza snovi z uporabo translacijsko kompatibilnih celičnih izvlečkov. Načeloma izvlečki celih celic vsebujejo vse makromolekule in komponente, potrebne za transkripcijo, prevajanje in celo posttranslacijsko modifikacijo.
Te komponente vključujejo RNA polimerazo, regulativne proteinske faktorje, transkripcijske oblike, ribosome in tRNA. Pri dodajanjukofaktorji, nukleotidi in posebna genska šablona, lahko ti izvlečki sintetizirajo zanimive beljakovine v nekaj urah.
Čeprav niso trajnostni za obsežno proizvodnjo, sistemi za izražanje beljakovin brez celic ali in vitro (IVT) ponujajo številne prednosti pred običajnimi sistemi in vivo.
Izražanje brez celic omogoča hitro sintezo rekombinantnih formulacij brez vključevanja celične kulture. Sistemi brez celic omogočajo označevanje proteinov z modificiranimi aminokislinami, pa tudi ekspresijo spojin, ki so podvržene hitri proteolitični razgradnji z intracelularnimi proteazami. Poleg tega je lažje izražati veliko različnih proteinov hkrati z uporabo brezcelične metode (na primer testiranje mutacij beljakovin z izražanjem majhnega obsega iz številnih različnih šablon rekombinantne DNK). V tem reprezentativnem poskusu je bil sistem IVT uporabljen za izražanje človeške kaspaze-3 proteina.
Sklepi in prihodnji obeti
Proizvodnjo rekombinantnih beljakovin je zdaj mogoče obravnavati kot zrelo disciplino. To je rezultat številnih postopnih izboljšav pri čiščenju in analizi. Trenutno se programi odkrivanja zdravil redko ustavijo zaradi nezmožnosti proizvodnje ciljne beljakovine. Vzporedni postopki za izražanje, čiščenje in analizo več rekombinantnih snovi so zdaj dobro poznani v številnih laboratorijih po vsem svetu.
Proteinski kompleksi in vse večji uspeh pri izdelavisolubilizirane membranske strukture bodo zahtevale več sprememb, da bodo sledile povpraševanju. Pojav učinkovitih pogodbenih raziskovalnih organizacij za bolj redno oskrbo z beljakovinami bo omogočil prerazporeditev znanstvenih virov za soočanje s temi novimi izzivi.
Poleg tega bi morali vzporedni delovni tokovi omogočiti ustvarjanje popolnih knjižnic spremljane snovi, da bi omogočili novo identifikacijo ciljev in napredno presejanje, skupaj s tradicionalnimi projekti odkrivanja zdravil z majhnimi molekulami.
