Pri proučevanju snovi v organski kemiji se za določanje vsebnosti določenih spojin uporablja več kot ducat različnih kvalitativnih reakcij. Takšna vizualna analiza vam omogoča, da takoj razumete, ali so prisotne potrebne snovi, in če niso prisotne, lahko znatno zmanjšate nadaljnje poskuse za njihovo identifikacijo. Te reakcije vključujejo ninhidrin, ki je glavni pri vizualnem določanju amino spojin.
Kaj je to?
Ninhidrin je dikarbonilna spojina, ki vsebuje en aromatski obroč z dodatkom heterocikla, katerega drugi atom ima 2 hidroksilni skupini (OH-). Ta snov je pridobljena z neposredno oksidacijo inandiona - 1, 3, zato ima po mednarodni nomenklaturi naslednje ime: 2, 2 - dihidroksiinandion -1, 3 (slika 1).
Čisti ninhidrin je rumen ali bel kristalbarve, ki se ob segrevanju dobro raztopijo v vodi in drugih polarnih organskih topilih, kot je aceton. To je precej škodljiva snov, če pride v stik s kožo ali sluznico v velikih količinah, povzroči draženje, tudi pri vdihavanju. S to spojino delajte previdno in le z rokavicami, saj ko pride v stik s kožo, reagira z beljakovinami kožnih celic in jo obarva vijolično.
Reaktivne snovi
Kot že omenjeno, se reakcija ninhidrina uporablja predvsem za vizualno določanje vsebnosti amino spojin:
- α-aminokisline (vključno v beljakovinah);
- amino sladkorji;
- alkaloidi, ki vsebujejo –NH2 in -NH skupine;
- različni amini.
Upoštevati je treba, da sekundarni in terciarni amini včasih reagirajo zelo šibko, zato je za potrditev njihove prisotnosti potrebnih več raziskav.
Za kvantitativno določanje se uporabljajo različne metode kromatografije, na primer papirna kromatografija (BC), tankoplastna kromatografija (TLC) ali spiranje trdnih nosilcev z raztopino ninhidrina v različnih medijih.
Ta reakcija ni specifična za amino spojine, saj lahko reagent vstopi vanjo z vsemi naenkrat. Vendar pa ima na strani reakcijskih produktov posebnost v obliki sproščanja mehurčkov ogljikovega dioksida (CO2), kar je značilno le pri interakciji z α-amino kisline.
Funkcije mehanizma
BV literaturi obstajajo različne interpretacije reakcijske enačbe ninhidrina. Nekateri raziskovalci izpuščajo tvorbo hirindantina iz 2-aminoinandiona, ki s sodelovanjem amoniaka in ninhidrina tvori tudi barvilno snov, imenovano "Ruemanova vijolična" (ali "Ruemanova modra"), drugi pa, nasprotno, domnevajo le njeno sodelovanje brez prisotnosti vmesnih amino produktov. V zapisu same reakcije je tudi nekaj zanimivih točk, zlasti to zadeva metode vezave amino derivata ninhidrina na njegovo glavno molekulo, da nastane barvilo. Vprašljiva ostaja tudi navedba mesta »hodečega vodika«, ki ga dobi vmesni amin iz vodnega medija: lahko je v ketonski skupini ali poleg –NH2.
V resnici je odtenek z atomom H nepomemben, saj njegov položaj v spojini ne igra posebne vloge v poteku reakcije, zato nanj ne bi smeli biti pozorni. Kar se tiče izpustitve ene od možnih stopenj, je tu razlog v teoretičnem vidiku: do sedaj natančen mehanizem nastanka Ruemanove vijolične barve ni bil natančno določen, zato je mogoče najti precej različne sheme ninhidrinske reakcije.
Najbolj popoln možni potek interakcije reagenta z amino spojinami bo predlagan spodaj.
reakcijski mehanizem
Najprej, ninhidrin interagira z α-amino kislino, jo pritrdi na mestu cepitve hidroksilnih skupin in tvori kondenzacijski produkt (slika 2a). Nato se slednji uniči, pri čemer se sprosti vmesni amin, aldehid in ogljikov dioksid (slika 2b). Od končnega izdelka ob spajanjuninhidrina, se sintetizira Ruemanova vijolična struktura (diketonhidrindenketohidrinamin, slika 2c). Nakazana je tudi možna tvorba hirindantina (reduciranega ninhidrina) iz vmesnega amina, ki se v prisotnosti amoniaka (natančneje amonijevega hidroksida) s presežkom samega reagenta spremeni tudi v barvno spojino (slika 2d).
Nastajanje hidrindantina je dokazal sam Rueman, ko vodikov sulfid deluje na molekulo ninhidrina. Ta spojina se lahko raztopi v natrijevem karbonatu Na2CO3 in raztopino obarva temno rdeče. In ko dodamo razredčeno klorovodikovo kislino, se hidrindantin obori.
Najverjetneje so vmesni amin, hidridantin, ninhidrin in struktura barvila zaradi svoje nestabilnosti pri segrevanju v nekem ravnovesju, kar omogoča prisotnost več dodatnih stopenj.
Ta mehanizem je primeren za razlago reakcije ninhidrina z drugimi amino spojinami, z izjemo stranskih produktov, ki nastanejo pri odstranitvi preostale strukture iz –NH2, -NH ali -N.
Biuretni test in druge reakcije na beljakovine
Kvalitativna analiza za peptidne vezi tudi nebeljakovinskih struktur se lahko izvede ne samo s sodelovanjem zgornjega reagenta. Vendar v primeru reakcije ninhidrina na beljakovine interakcija ne poteka vzdolž skupin –CO-NH‒, temveč vzdolž aminskih skupin. Obstaja tako imenovana "biuretna reakcija", za katero je značilno dodajanje ionov v raztopino z amino spojinami.dvovalentni baker iz CuSO4 ali Cu(OH)2 v alkalnem mediju (slika 3).
Med analizo ob prisotnosti potrebnih struktur raztopina postane temno modra zaradi vezave peptidnih vezi v barvni kompleks, ki loči en reagent od drugega. Zato so reakcije biureta in ninhidrina univerzalne glede na beljakovinske in nebeljakovinske strukture s skupino –CO-NH‒.
Pri določanju cikličnih aminokislin uporabimo ksantoproteinsko reakcijo s koncentrirano raztopino dušikove kisline HNO3 , ki pri nitriranju da rumeno barvo. Kapljica reagenta na koži ima tudi rumeno barvo, ker reagira z aminokislinami v kožnih celicah. Dušikova kislina lahko povzroči opekline, zato je treba z njo ravnati tudi v rokavicah.
Primeri interakcije z amino spojinami
Ninhidrinska reakcija za α-aminokisline daje dober vizualni rezultat, razen struktur barvnega prolina in hidroksiprolina, ki reagirajo s tvorbo rumene barve. Možno razlago za ta učinek so našli v drugih okoljskih razmerah interakcije ninhidrina s temi strukturami.
reakcija z amino skupino
Ker test ni specifičen, vizualna detekcija alanina z ninhidrinsko reakcijo v mešanici ni možna. Vendar pa lahko s papirno kromatografijo pri nanašanju vzorcev različnih α-aminokislin, brizganju z vodno raztopino ninhidrina in razvijanju v posebnem mediju,izračunajte količinsko sestavo ne samo zahtevane spojine, ampak tudi mnogih drugih.
Shematsko interakcija alanina z ninhidrinom sledi istemu principu. Na reagent se veže na aminsko skupino in se pod delovanjem aktivnih hidronijevih ionov (H3O+) odcepi pri ogljiku -dušikova vez, ki se razgradi v acetaldehid (CH3COH) in ogljikov dioksid (CO2). Druga molekula ninhidrina se veže na dušik, izpodriva molekule vode in nastane barvna struktura (slika 4).
Reakcija s heterociklično amino spojino
Reakcija ninhidrina s prolinom je specifična predvsem pri kromatografskih analizah, saj takšne strukture v kislem mediju najprej porumenijo, nato pa v nevtralnem vijolično. Raziskovalci to pojasnjujejo s posebnostjo preureditve cikla v vmesni spojini, na katero vpliva ravno prisotnost velikega števila vodikovih protonov, ki dopolnjujejo zunanjo energijsko raven dušika.
Uničenje heterocikla ne pride, na 4. atom ogljika pa je nanj pritrjena druga molekula ninhidrina. Pri nadaljnjem segrevanju se nastala struktura v nevtralnem mediju spremeni v Rueman vijolično (slika 5).
Priprava glavnega reagenta
Ninhidrinski test se izvaja z različnimi raztopinami, odvisno od raztapljanja amino struktur v določenih organskih inanorganske spojine.
Glavni reagent je priprava 0,2% raztopine v vodi. To je vsestranska mešanica, saj se večina spojin dobro raztopi v H2O. Za pridobitev sveže pripravljenega reagenta se vzorec 0,2 g kemično čistega ninhidrina razredči v 100 ml vode.
Opozoriti je treba, da je za nekatere analizirane raztopine ta koncentracija nezadostna, zato lahko pripravimo 1% ali 2% raztopine. To je značilno za izvlečke iz zdravilnih surovin, saj vsebujejo različne razrede amino spojin.
Pri izvajanju kromatografskih študij lahko raztopine, na primer pri izpiranju zmesi na trdnem nosilcu skozi kolono, pripravimo v alkoholu, dimetilsulfoksidu, acetonu in drugih polarnih topilih - vse bo odvisno od topila določenega amino strukture.
Prijava
Reakcija ninhidrina omogoča odkrivanje številnih amino spojin v raztopini, zaradi česar je bila ena prvih, ki so jo uporabili pri kvalitativni analizi organskih snovi. Vizualna determinacija bistveno zmanjša število poskusov, zlasti pri analizi slabo raziskanih rastlin, zdravil in dozirnih oblik, pa tudi neznanih raztopin in mešanic.
V forenziki se ta metoda pogosto uporablja za ugotavljanje prisotnosti sledi znoja na kateri koli površini.
Tudi kljub nespecifičnosti reakcije je umik ninhidrinske reakcije iz kemične prakse nemogoč, sajzamenjava te snovi z manj strupenimi analogi (na primer oksolinom) je dokazala, da imajo slabšo občutljivost na amino skupine in ne dajejo dobrih rezultatov pri fotometričnih analizah.
