Sodobna biologija navdušuje z edinstvenostjo in obsegom svojih odkritij. Danes ta znanost proučuje večino procesov, ki so skriti našim očem. To je izjemno za molekularno biologijo – eno od obetavnih področij, ki pomaga razkriti najbolj zapletene skrivnosti žive snovi.
Kaj je povratna transkripcija
Povratna transkripcija (na kratko RT) je specifičen proces, značilen za večino virusov RNA. Njegova glavna značilnost je sinteza dvoverižne molekule DNK, ki temelji na sporočilni RNA.
OT ni značilen za bakterije ali evkariontske organizme. Glavni encim, reverzetaza, ima ključno vlogo pri sintezi dvoverižne DNK.
zgodovina odkritij
Zamisel, da bi molekula ribonukleinske kisline lahko postala predloga za sintezo DNK, je do sedemdesetih let prejšnjega stoletja veljala za absurdno. Nato sta B altimore in Temin, ki sta delala ločeno drug od drugega, skoraj istočasno odkrila nov encim. Imenovali so ga od RNA-odvisne DNA polimeraze ali reverzne transkriptaze.
Odkritje tega encima je brezpogojno potrdilo obstoj organizmovzmožen povratne transkripcije. Oba znanstvenika sta leta 1975 prejela Nobelovo nagrado. Čez nekaj časa je Engelhardt predlagal alternativno ime za reverzno transkriptazo - revertaza.
Zakaj je OT v nasprotju z osrednjo dogmo molekularne biologije
Osrednja dogma je koncept zaporedne sinteze beljakovin v kateri koli živi celici. Takšna shema je zgrajena iz treh komponent: DNK, RNA in beljakovin.
Po osrednji dogmi se lahko RNA sintetizira izključno na predlogi DNK in šele nato je RNA vključena v izgradnjo primarne strukture proteina.
Ta dogma je bila uradno sprejeta v znanstveni skupnosti pred odkritjem reverzne transkripcije. Ni presenetljivo, da so znanstveniki že dolgo zavračali idejo o povratni sintezi DNK iz RNA. Šele leta 1970, skupaj z odkritjem reversetaze, se je to vprašanje končalo, kar se je odrazilo v konceptu sinteze beljakovin.
Povrnitev ptičjih retrovirusov
Proces reverzne transkripcije ni popoln brez sodelovanja RNA-odvisne DNA polimeraze. Revertaza aviarnega retrovirusa je bila doslej raziskana v največji meri.
Le približno 40 molekul tega proteina je mogoče najti v enem virionu te družine virusov. Beljakovina je sestavljena iz dveh podenot, ki sta v enakem številu in opravljata tri pomembne funkcije reversease:
1) Sinteza molekule DNK tako na enoverižni/dvoverižni RNA predlogi kot na osnovi deoksiribonukleinskih kislin.
2) Aktivacija RNaze H, katere glavna vloga je, dacepitev molekule RNA v kompleksu RNA-DNA.
3) Uničenje delov molekul DNK za vstavitev v evkariontski genom.
mehanizem OT
Koraki povratne transkripcije se lahko razlikujejo glede na družino virusov, tj. glede na vrsto njihovih nukleinskih kislin.
Najprej razmislimo o tistih virusih, ki uporabljajo reversetazo. Tukaj je postopek OT razdeljen na 3 korake:
1) Sinteza verige "-" RNA na predlogi "+" verige RNA.
2) Uničenje "+" verige RNA v kompleksu RNA-DNA z uporabo encima RNAze H.
3) Sinteza dvoverižne molekule DNK na predlogi "-" verige RNA.
Ta način razmnoževanja virionov je značilen za nekatere onkogene viruse in virus humane imunske pomanjkljivosti (HIV).
Omeniti velja, da je za sintezo katere koli nukleinske kisline na RNA predlogi potrebno seme ali temeljni premaz. Primer je kratko zaporedje nukleotidov, ki je komplementarno 3' koncu molekule RNA (predloge) in ima pomembno vlogo pri zagonu sinteze.
Ko so že pripravljene dvoverižne molekule DNK virusnega izvora integrirane v evkariontski genom, se začne običajen mehanizem sinteze virionskih beljakovin. Posledično celica, ki jo "ujeta" virus, postane tovarna za proizvodnjo virionov, kjer se v velikih količinah tvorijo potrebne molekule beljakovin in RNA.
Drug način reverzne transkripcije temelji na delovanju RNA sintetaze. Ta protein je aktiven v paramiksovirusih, rabdovirusih, pikornovirusih. V tem primeru ni tretje stopnje OT – formacijedvoverižna DNK in namesto tega se sintetizira veriga "+" RNA na predlogi virusne verige "-" RNA in obratno.
Ponavljanje takšnih ciklov vodi do podvajanja virusnega genoma in do tvorbe mRNA, ki je sposobna sinteze beljakovin v pogojih okužene evkariontske celice.
Biološki pomen reverzne transkripcije
Proces OT je izjemnega pomena v življenjskem ciklu številnih virusov (predvsem retrovirusov, kot je HIV). RNA viriona, ki je napadel evkariontsko celico, postane šablona za sintezo prve verige DNK, na kateri ni težko dokončati druge verige.
Dobljena dvoverižna DNK virusa je integrirana v evkariontski genom, kar vodi do aktivacije procesov sinteze virionskih beljakovin in do pojava velikega števila njegovih kopij znotraj okužene celice. To je glavna naloga Revertase in OT na splošno za virus.
Povratna transkripcija se lahko pojavi tudi pri evkariontih v okviru retrotranspozonov – mobilnih genetskih elementov, ki se lahko neodvisno prenašajo iz enega dela genoma v drugega. Takšni elementi so po mnenju znanstvenikov povzročili evolucijo živih organizmov.
Retrotranspozon je del evkariontske DNK, ki kodira več beljakovin. Ena od njih, reversetaza, je neposredno vključena v delokalizacijo takega retrotransporozona.
Uporaba OT v znanosti
Od trenutka, ko je bila reversetaza izolirana v njeni čisti obliki, so biologi prevzeli proces reverzne transkripcije. Študija mehanizma OT še vedno pomaga brati zaporedja najpomembnejših človeških beljakovin.
Dejstvo je, da genom evkariontov, vključno z nami, vsebuje neinformativne regije, imenovane introni. Ko iz takšne DNK preberemo nukleotidno zaporedje in nastane enoverižna RNA, slednja izgubi introne in kodira izključno beljakovine. Če se DNK sintetizira z uporabo reverznetaze na predlogi RNA, jo je enostavno zaporediti in ugotoviti vrstni red nukleotidov.
Nukleinska kislina, ki je nastala z reverzno transkriptazo, se imenuje cDNA. Pogosto se uporablja v verižni reakciji s polimerazo (PCR) za umetno povečanje števila kopij nastale kopije cDNA. Ta metoda se ne uporablja samo v znanosti, ampak tudi v medicini: laboratorijski pomočniki ugotavljajo podobnost takšne DNK z genomi različnih bakterij ali virusov iz skupne knjižnice. Sinteza vektorjev in njihova vnos v bakterije je eno od obetavnih področij biologije. Če se RT uporablja za tvorbo DNK ljudi in drugih organizmov brez intronov, se takšne molekule zlahka vnesejo v bakterijski genom. Tako slednje postanejo tovarne za proizvodnjo snovi, ki so potrebne za človeka (na primer encimi).
