Koncept imobiliziranih encimov se je prvič pojavil v drugi polovici 20. stoletja. Medtem je bilo leta 1916 ugotovljeno, da je saharoza, sorbirana na ogljiku, ohranila svojo katalitično aktivnost. Leta 1953 sta D. Schleit in N. Grubhofer izvedla prvo vezavo pepsina, amilaze, karboksipeptidaze in RNaze z netopnim nosilcem. Koncept imobiliziranih encimov je bil legaliziran leta 1971. To se je zgodilo na prvi konferenci o inženirski encimologiji. Trenutno se koncept imobiliziranih encimov obravnava v širšem pomenu, kot je bil ob koncu 20. stoletja. Oglejmo si to kategorijo podrobneje.
Splošne informacije
Imobilizirani encimi so spojine, ki so umetno vezane na netopen nosilec. Vendar pa ohranijo svoje katalitične lastnosti. Trenutno se ta proces obravnava z dveh vidikov – v okviru delne in popolne omejitve svobode gibanja beljakovinskih molekul.
Dignity
Znanstveniki so ugotovili nekatere prednosti imobiliziranih encimov. Ker delujejo kot heterogeni katalizatorji, jih je mogoče zlahka ločiti od reakcijskega medija. V okviru raziskave je bilo ugotovljeno, da se lahko uporaba imobiliziranih encimov ponovi. Med postopkom vezave povezave spremenijo svoje lastnosti. Pridobijo specifičnost in stabilnost substrata. Hkrati je njihova dejavnost odvisna od okoljskih razmer. Imobilizirani encimi so trpežni in imajo visoko stopnjo stabilnosti. Večja je od na primer prostih encimov za tisoče, deset tisočkrat. Vse to zagotavlja visoko učinkovitost, konkurenčnost in ekonomičnost tehnologij, v katerih so prisotni imobilizirani encimi.
Mediji
J. Poratu je opredelil ključne lastnosti idealnih materialov, ki se uporabljajo pri imobilizaciji. Nosilci morajo imeti:
- Netopnost.
- Visoka biološka in kemična odpornost.
- Možnost hitre aktivacije. Nosilci bi morali zlahka postati reaktivni.
- Pomembna hidrofilnost.
- Potrebna prepustnost. Njegov indikator mora biti enako sprejemljiv tako za encime kot za koencime, reakcijske produkte in substrate.
Trenutno ni materiala, ki bi v celoti ustrezal tem zahtevam. Kljub temu se v praksi uporabljajo nosilci, ki so primerni za imobilizacijo.določena kategorija encimov pod posebnimi pogoji.
Razvrstitev
Materiale, v povezavi s katerimi se spojine pretvarjajo v imobilizirane encime, glede na naravo delimo na anorganske in organske. Vezava številnih spojin se izvaja s polimernimi nosilci. Ti organski materiali so razdeljeni v 2 razreda: sintetični in naravni. V vsakem od njih se razlikujejo skupine glede na strukturo. Anorganske nosilce predstavljajo predvsem materiali iz stekla, keramike, gline, silikagela in grafitne črnine. Pri delu z materiali so priljubljene metode suhe kemije. Imobilizirane encime dobimo s prevleko nosilcev s filmom iz titanovih, aluminijevih, cirkonijevih, hafnijevih oksidov ali s predelavo z organskimi polimeri. Pomembna prednost materialov je enostavnost regeneracije.
proteinski nosilci
Najbolj priljubljeni so lipidni, polisaharidni in beljakovinski materiali. Med slednjimi velja izpostaviti strukturne polimere. Ti vključujejo predvsem kolagen, fibrin, keratin in želatino. Takšni proteini so v naravnem okolju zelo razširjeni. So cenovno ugodne in ekonomične. Poleg tega imajo veliko število funkcionalnih skupin za vezavo. Beljakovine so biološko razgradljive. To omogoča razširitev uporabe imobiliziranih encimov v medicini. Medtem imajo beljakovine tudi negativne lastnosti. Pomanjkljivosti uporabe imobiliziranih encimov na nosilcih beljakovin so visoka imunogenost slednjih, pa tudisposobnost uvajanja le določenih skupin v reakcije.
polisaharidi, aminosaharidi
Od teh materialov se najpogosteje uporabljajo hitin, dekstran, celuloza, agaroza in njihovi derivati. Da bi bili polisaharidi bolj odporni na reakcije, so njihove linearne verige zamrežene z epiklorohidrinom. Različne ionogene skupine se prosto vnašajo v mrežne strukture. Hitin se kopiči v velikih količinah kot odpadek med industrijsko predelavo kozic in rakov. Ta snov je kemično odporna in ima dobro opredeljeno porozno strukturo.
sintetični polimeri
Ta skupina materialov je zelo raznolika in dostopna. Vključuje polimere na osnovi akrilne kisline, stirena, polivinil alkohola, poliuretana in poliamidnih polimerov. Večina jih je mehansko močnih. V procesu transformacije zagotavljajo možnost spreminjanja velikosti por v dokaj širokem razponu, pri čemer uvajajo različne funkcionalne skupine.
Metode vezave
Trenutno obstajata dve bistveno različni možnosti za imobilizacijo. Prvi je pridobiti spojine brez kovalentnih vezi z nosilcem. Ta metoda je fizična. Druga možnost vključuje nastanek kovalentne vezi z materialom. To je kemična metoda.
Adsorpcija
Z njo se pridobijo imobilizirani encimi, tako da se zdravilo drži na površini nosilca zaradidisperzije, hidrofobne, elektrostatične interakcije in vodikove vezi. Adsorpcija je bila prvi način za omejitev mobilnosti elementov. Vendar tudi zdaj ta možnost ni izgubila svoje pomembnosti. Poleg tega se adsorpcija šteje za najpogostejšo metodo imobilizacije v industriji.
Značilnosti metode
Znanstvene publikacije opisujejo več kot 70 encimov, pridobljenih z adsorpcijsko metodo. Nosilci so bili predvsem porozno steklo, različne gline, polisaharidi, aluminijevi oksidi, sintetični polimeri, titan in druge kovine. Slednji so najpogosteje uporabljeni. Učinkovitost adsorpcije zdravila na nosilcu je določena s poroznostjo materiala in specifično površino.
Mehanizem delovanja
Adsorpcija encimov na netopne materiale je preprosta. To se doseže s stikom vodne raztopine zdravila z nosilcem. Prehaja lahko na statični ali dinamični način. Raztopino encima zmešamo s svežo usedlino, na primer titanovim hidroksidom. Spojino nato posušimo v blagih pogojih. Encimska aktivnost med takšno imobilizacijo se ohrani skoraj 100 %. Hkrati specifična koncentracija doseže 64 mg na gram nosilca.
Negativni trenutki
Slabosti adsorpcije vključujejo nizko trdnost pri vezavi encima in nosilca. V procesu spreminjanja reakcijskih pogojev lahko opazimo izgubo elementov, kontaminacijo produktov in desorpcijo beljakovin. Za izboljšanje močizavezujoči nosilci so vnaprej spremenjeni. Zlasti materiale obdelamo s kovinskimi ioni, polimeri, hidrofobnimi spojinami in drugimi polifunkcionalnimi sredstvi. V nekaterih primerih se zdravilo samo spremeni. Toda pogosto to vodi do zmanjšanja njegove aktivnosti.
Vključitev v gel
Ta možnost je zaradi svoje edinstvenosti in preprostosti precej pogosta. Ta metoda ni primerna samo za posamezne elemente, temveč tudi za večencimske komplekse. Vgradnjo v gel lahko izvedemo na dva načina. V prvem primeru se zdravilo kombinira z vodno raztopino monomera, po kateri se izvede polimerizacija. Posledično se pojavi prostorska struktura gela, ki vsebuje encimske molekule v celicah. V drugem primeru se zdravilo vnese v raztopino končnega polimera. Nato se postavi v gelno stanje.
Vdor v prosojne strukture
Bistvo te metode imobilizacije je ločitev vodne raztopine encima od substrata. Za to se uporablja polprepustna membrana. Omogoča, da elementi kofaktorjev in substratov z nizko molekulsko maso prehajajo in zadrži velike molekule encimov.
Mikrokapsulacija
Obstaja več možnosti za vgradnjo v prosojne strukture. Med njimi sta najbolj zanimiva mikrokapsulacija in vgradnja beljakovin v liposome. Prvo možnost je leta 1964 predlagal T. Chang. Sestoji iz dejstva, da se encimska raztopina vnese v zaprto kapsulo, katere stene so polprepustne.polimer. Pojav membrane na površini je posledica reakcije medfazne polikondenzacije spojin. Eden od njih je raztopljen v organski, drugi pa v vodni fazi. Primer je tvorba mikrokapsule, pridobljene s polikondenzacijo halogenida sebacinske kisline (organska faza) in heksametilendiamina-1, 6 (vodna faza). Debelina membrane se izračuna v stotinkah mikrometra. Velikost kapsul je na stotine ali desetine mikrometrov.
Vgradnja v liposome
Ta metoda imobilizacije je blizu mikrokapsulaciji. Liposomi so predstavljeni v lamelarnih ali sferičnih sistemih lipidnih dvoslojev. Ta metoda je bila prvič uporabljena leta 1970. Za izolacijo liposomov iz lipidne raztopine uparimo organsko topilo. Preostali tanek film se dispergira v vodni raztopini, v kateri je prisoten encim. Med tem procesom pride do samosestavljanja lipidnih dvoslojnih struktur. Takšni imobilizirani encimi so v medicini precej priljubljeni. To je posledica dejstva, da je večina molekul lokaliziranih v lipidnem matriksu bioloških membran. Imobilizirani encimi, vključeni v liposome, so najpomembnejši raziskovalni material v medicini, ki omogoča preučevanje in opisovanje vzorcev vitalnih procesov.
Nastajanje novih obveznic
Imobilizacija z tvorbo novih kovalentnih verig med encimi in nosilci velja za najbolj razširjeno metodo za pridobivanje industrijskih biokatalizatorjev.destinacijo. Za razliko od fizikalnih metod ta možnost zagotavlja nepopravljivo in močno vez med molekulo in materialom. Njegovo nastajanje pogosto spremlja stabilizacija zdravila. Hkrati pa lokacija encima na razdalji 1. kovalentne vezi glede na nosilec povzroča določene težave pri izvajanju katalitičnega procesa. Molekula je ločena od materiala s pomočjo vložka. Pogosto se uporablja kot poli- in bifunkcionalna sredstva. Zlasti so to hidrazin, cianogen bromid, glutarni diahedrid, sulfuril klorid itd. Na primer, za odstranitev galaktoziltransferaze se med nosilcem in encimom -CH2- vstavi naslednje zaporedje. NH-(CH 2)5-CO-. V takšni situaciji so v strukturi prisotni vložek, molekula in nosilec. Vsi so povezani s kovalentnimi vezmi. Temeljnega pomena je potreba po uvedbi v reakcijo funkcionalnih skupin, ki niso bistvene za katalitično funkcijo elementa. Torej so glikoproteini praviloma pritrjeni na nosilec ne prek beljakovin, ampak preko ogljikovega hidrata. Kot rezultat dobimo bolj stabilne in aktivne imobilizirane encime.
Celice
Zgoraj opisane metode veljajo za univerzalne za vse vrste biokatalizatorjev. Sem spadajo med drugim celice, subcelične strukture, katerih imobilizacija je v zadnjem času zelo razširjena. To je posledica naslednjega. Ko so celice imobilizirane, ni potrebe po izolaciji in čiščenju encimskih pripravkov ali uvajanju kofaktorjev v reakcije. Posledično postane mogočesistemi, ki izvajajo večstopenjske neprekinjene procese.
Uporaba imobiliziranih encimov
V veterinarski medicini, industriji in drugih gospodarskih sektorjih so zdravila, pridobljena z zgornjimi metodami, zelo priljubljena. Pristopi, ki so bili razviti v praksi, omogočajo rešitev problemov ciljnega vnosa zdravil v telo. Imobilizirani encimi so omogočili pridobivanje zdravil s podaljšanim delovanjem z minimalno alergenostjo in toksičnostjo. Trenutno znanstveniki rešujejo probleme, povezane z biokonverzijo mase in energije, z uporabo mikrobioloških pristopov. Medtem pa k delu pomembno prispeva tudi tehnologija imobiliziranih encimov. Obeti za razvoj se zdijo precej široki. Ena ključnih vlog v procesu spremljanja stanja okolja naj bi torej v prihodnje pripadala novim vrstam analiz. Zlasti govorimo o bioluminiscentnih in encimskih imunskih metodah. Pri predelavi lignoceluloznih surovin so še posebej pomembni napredni pristopi. Imobilizirani encimi se lahko uporabljajo kot ojačevalniki šibkih signalov. Aktivni center je lahko pod vplivom nosilca, ki je pod ultrazvokom, mehanskim stresom ali podvržen fitokemijskim transformacijam.
