Metoda tkivne kulture je eno glavnih orodij sodobne biotehnologije, ki omogoča reševanje praktičnih problemov rastlinske fiziologije, biokemije in genetike. Umetno gojenje materiala se izvaja pod določenimi pogoji: sterilizacija, nadzor temperature in izpostavljenost posebnemu hranilnemu mediju.
Essence
Metoda kulture tkiv je njihovo dolgotrajno konzerviranje in/ali umetno gojenje v laboratorijskih pogojih na hranilnem mediju. Ta tehnologija vam omogoča, da ustvarite biološki model za preučevanje različnih procesov v celicah, ki obstajajo zunaj telesa rastlin, ljudi in živali.
Razmnoževanje kulture rastlinskega tkiva temelji na lastnosti totipotentnosti – sposobnosti celic, da se razvijejo v celoten organizem. Pri živalih se to uresničuje le v oplojenih jajčecih (z izjemo nekaterih vrst koelenteratov).
zgodovina razvoja
Prve poskuse gojenja rastlinskih tkiv so naredili nemški znanstveniki na prelomu iz 19. v 20. stoletje. Kljub temu, da niso bili uspešni, so bile oblikovane številne ideje, ki so bile kasneje potrjene.
Leta 1922 sta W. Robbins in W. Kotte neodvisno drug od drugega uspela gojiti konice koruze in paradižnikovih korenin na umetnem hranilnem mediju. Podrobna študija tehnik celične in tkivne kulture se je začela v tridesetih letih prejšnjega stoletja. 20. stoletje R. Gautre in F. White sta dokazala, da lahko s periodično presaditvijo tkivnih kultur v svež hranilni medij rastejo v nedogled.
Do leta 1959 je bilo v laboratorijskih pogojih gojenih 142 rastlinskih vrst. V drugi polovici XX stoletja. začela se je tudi uporaba razpršenih (ločenih) celic.
Vrste testnega materiala
Obstajata 2 glavni vrsti kultur rastlinskega tkiva:
- Proizvedeno brez uničenja in ohranjanja značilnih lastnosti, ki so lastne živemu organizmu.
- Pridobljeno z razgradnjo (kemično, encimsko ali mehansko) iz primarnega tkiva. Lahko nastane iz ene ali več celičnih kultur.
Po načinu pridelave se razlikujejo naslednje metode:
- na "napajalnem sloju", v katerem se z delitvijo celic iste rastlinske vrste izloča snov, ki spodbuja rast tkiva;
- uporaba medicinske sestre poleg kultiviranih celic;
- uporaba hranilnega medija iz izolirane skupine deljivih celic;
- gojenje posameznih posameznih celic v mikrokapljici, nasičeni s sestavo.
Gojenje iz posameznih celic je polno določenih težav. Da bi jih umetno "prisilili" k delitvi, morajo prejeti signal iz sosednjih, aktivno delujočih celic.
Ena od glavnih vrst tkiva za fiziološke raziskave je kalus, ki nastane pod škodljivimi zunanjimi dejavniki (običajno mehanske poškodbe). Imajo sposobnost, da izgubijo specifične lastnosti, ki so značilne za prvotno tkivo. Posledično se celice kalusa začnejo aktivno deliti in nastajajo deli rastline.
Potrebni pogoji
Uspeh metode tkivne in celične kulture je odvisen od naslednjih dejavnikov:
- Skladnost s sterilnostjo. Za presaditev se uporabljajo posebne škatle s prečiščenim zrakom, opremljene z ultravijoličnimi žarnicami. Orodja in materiale, oblačila in roke osebja je treba aseptično obdelati.
- Uporaba posebej izbranih hranilnih medijev, ki vsebujejo vire ogljika in energije (običajno saharozo in glukozo), mikro- in makrohranila, regulatorje rasti (avksini, citokinini), vitamine (tiamin, riboflavin, askorbinsko in pantotensko kislino in druge).
- Skladnost s temperaturo (18-30 °C), svetlobnimi pogoji in vlažnostjo (60-70%). Večina kultur tkiva kalusa se goji pri sobni svetlobi, saj ne vsebujejo kloroplastov, vendar nekatere rastline potrebujejo osvetlitev ozadja.
Trenutno pripravljenokomercialne sestave (Murasige in Skoog, Gamborg in Eveleg, White, Kao in Mikhailyuk in drugi).
Prednosti in slabosti
Prednosti metode celične in tkivne kulture so:
- dobra ponovljivost dobljenih rezultatov;
- regulacija medceličnih interakcij;
- nizka poraba reagentov;
- genetska homogenost celičnih linij;
- možnost mehanizacije procesa pridelave;
- nadzor nad pogoji v kletki;
- skladiščenje živih kultur pri nizkih temperaturah.
Pomanjkljivost te biotehnologije je:
- treba izpolnjevati stroge pogoje asepse;
- nestabilnost lastnosti celic in možnost njihovega nezaželenega mešanja;
- visoki stroški kemikalij;
- nepopolna enakovrednost kultiviranih tkiv in celic v živem organizmu.
Prijava
Metoda kulture tkiva, uporabljena za raziskave:
- procesi znotraj celic (sinteza DNK, RNA in beljakovin, presnova in vpliv nanjo s pomočjo zdravil);
- medcelične reakcije (prehod snovi skozi celične membrane, delo hormonsko-receptorskega kompleksa, sposobnost celic, da se oprimejo ena na drugo, tvorba histoloških struktur);
- interakcije z okoljem (absorpcija hranil, prenos okužb, procesi nastanka in razvojatumorji in drugi);
- rezultati genetskih manipulacij s celicami.
Obetavna področja biologije in farmakologije, pri razvoju katerih se uporablja ta tehnologija, so:
- pridobivanje učinkovitih herbicidov, regulatorjev rasti za agronomske pridelke, biološko aktivnih spojin za uporabo v proizvodnji zdravil (alkaloidi, steroidi in drugi);
- usmerjena mutageneza, vzreja novih hibridov, premagovanje postgamne nezdružljivosti;
- klonsko razmnoževanje, ki vam omogoča, da dobite veliko število genetsko enakih rastlin;
- vzgoja rastlin, odpornih proti virusom in brez virusov;
- kriopreservacija genskega sklada;
- rekonstrukcija tkiva, ustvarjanje virov izvornih celic (tkivni inženiring).
