barvanje po Gramu se pogosto uporablja v mikrobiologiji, saj je eden najlažjih načinov za razlikovanje bakterij glede na sestavo njihove celične stene. Po Gramu lahko vse bakterije razdelimo na gram-pozitivne (Gram (+)) in gram-negativne (Gram (-)). Metoda obarvanja po Gramu je bila razvita leta 1884 in od takrat ni izgubila priljubljenosti, čeprav je bila večkrat spremenjena.
Struktura celične stene
barvanje po Gramu razkrije, ali je bakterija gram-pozitivna ali gram-negativna. Delitev bakterij na gram (+) in gram (-) poteka v skladu s strukturo njihove celične stene.
Celična stena vsebuje največjo količino peptidoglikana (mureina) - kompleksne snovi, ki vključuje peptapeptid in glikan. Glikan je sestavljen iz izmeničnih ostankov N-acetilglukozamina in N-acetilmuramske kisline, ki sta med seboj povezana z β-1,4-glikozidne vezi. Peptidoglikan zagotavlja ohranjanje oblike celic, osmotsko zaščito in antigenske funkcije.
Glavne razlike med gram-pozitivnimi in gram-negativnimi bakterijami
Različne bakterije imajo različno debelino plasti peptidoglikana. Pri bakterijah, ki jih uvrščamo med gram-pozitivne, se giblje od 15 do 80 nm, pri gram-negativnih pa od 2 do 8 nm. Hkrati imajo gram-negativne bakterije pod plastjo peptidoglikana posebno strukturo, ki je gram-pozitivne bakterije nimajo – periplazemski prostor. Ta prostor je napolnjen s hidrolitičnimi encimi - β-laktamazo, ribonukleazo 1, fosfatazo. Prav ti encimi so odgovorni za odpornost gram-negativnih bakterij na številne antibiotike.
Gram(-) peptidoglikanski sloj bakterij je vezan na lipopolisaharid, antigensko strukturo, ki vsebuje endotoksin. V Gram(+) bakterijah teihojske kisline opravljajo podobne funkcije.
Gram-negativne bakterije imajo dodatno strukturo - zunanjo membrano.
Bistvo metode barvanja
Preden začnete z barvanjem, pripravimo brise preučevanih bakterij. Da bi to naredili, vodo kapnemo na stekelce in vanjo dodamo kulturo mikroorganizmov z bakterijsko zanko. Potem, ko se voda popolnoma posuši, se razmaz fiksira - stekelce večkrat prenesemo nad plamen gorilnika. Barvanje po Gramu je učinkovitejše od barvanja z živimi bakterijami – molekule barvila se bolje vežejo na odmrle celice.
Barvanje poteka v več fazah:
- Majhni koščki filtrirnega papirja se položijo na fiksiran razmaz in vlijejo glavno barvilo - gentian violet ali metilen modro.
- Po 3-5 minutah odstranite barvni filtrirni papir in razmaz napolnite z Lugolovo raztopino za 1 minuto. V tem primeru pripravek potemni.
- Lugolovo raztopino odcedimo in razmaz obdelamo s čistim etilnim alkoholom: nekaj kapljic kapnemo na pripravek, po 20 sekundah odcedimo. Postopek se ponovi 2-3 krat.
- Sperite testno stekelce z destilirano vodo.
- Proizvaja dodatno obarvanje - zaključite pripravo s fuksinom. Po 1-2 minutah se barvilo spere.
- Ko se voda posuši, preglejte razmaz pod mikroskopom. Gram-pozitivne bakterije bodo modro-vijolične, Gram-negativne bakterije bodo rožnate ali rdeče.
Vzroki za različne vzorce obarvanja
Kot je opisano zgoraj, obarvanje bakterij po Gramu obarva po Gramu pozitivne bakterije modro-vijolično, Gram negativne bakterije pa rdeče ali rožnato. Razlog za diferencialno obarvanje bakterij s to metodo je, da potem, ko topna oblika gentian violet vstopi v celico, barvilo preide v netopno obliko joda. Med obdelavo bakterij z etilnim alkoholom se pod delovanjem tega nepolarnega topila iz membrane izločijo lipidi. Membrana nato postane porozna in ni več pomembna ovira za izpiranje barvila. Vendarpeptidoglikan je bolj odporen na nepolarna topila, vključno z alkoholom. On je tisti, ki preprečuje izpiranje barvila, zato bakterije z debelo plastjo mureina postanejo modro-vijolične (gram-pozitivne) in po zdravljenju z alkoholom ne spremenijo barve.
Tanka mureinska plast gram-negativnih bakterij ne more zadržati molekul barvila v celici, zato po delovanju alkohola postanejo brezbarvne - obarvajo gram-negativne.
Po izpostavitvi brisa fuksinu ostanejo bakterije, obarvane po Gramu, modro-vijolične, medtem ko po Gramu negativne bakterije postanejo rožnato rdeče.
Primeri gram(+) in gram(-) bakterij
Gram-negativne bakterije vključujejo cianobakterije, žveplove bakterije, železove bakterije, klamidijo, rikecije, ocetne bakterije, številne metilobakterije, tionske bakterije, arsenitobakterije, karboksibakterije.
Bifidobakterije, številne vodne bakterije, streptokoki in stafilokoki so po Gramu pozitivni.
